Unité: Génétique des Interactions Macromoléculaires

Responsable: Jacquier Alain

Nous étudions divers aspects du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae utilisée comme modèle de cellule eucaryote. Durant l'année 2005, les point forts de nos activités de recherche ont porté sur : 1) la mise en évidence exhaustive des petits ARN nucléolaires qui spécifient les sites de pseudouridylation dans l'ARNr, 2) l'étude des étapes tardives de la maturation et d'export des particules ribosomiques 60S, 3) la mise en évidence d'ARN cryptiques intergéniques dégradés par une machinerie nucléaire faisant intervenir une nouvelle poly(A)-polymerase.

La thématique générale du laboratoire est focalisée sur certaines étapes du métabolisme des ARN chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Ces voies métaboliques regroupent de nombreuses étapes qui vont de la transcription de ces molécules dans le noyau, jusqu'à leur dégradation dans le cytoplasme en passant par les étapes de maturation ainsi que le transport nucléocytoplasmique. Nous employons une démarche de type globale au départ, pour aboutir à une analyse spécifique de certains facteurs au final. Pour cela, nous utilisons différentes techniques génériques comme le double-hybride, les purifications biochimiques par affinité (TAP) et des cribles génétiques (cribles de co-létalité par exemple) afin d'identifier la fonction de nouveaux facteurs impliqués dans ces voies métaboliques. La combinaison de ces trois approches génériques nous permet de cerner l'étape dans laquelle sont impliqués ces facteurs. Nous faisons alors une analyse classique de ces candidats en réalisant des tests fonctionnels spécifiques de l'étape identifiée afin d'affiner leur caractérisation.

Idendification exhaustive chez la levure des petits ARN nucléolaires qui spécifient les sites de pseudouridylation dans l'ARNr.

Au cours de leur maturation, les ARN ribosomaux (ARNr) sont modifiés de façon covalente. La conversion des uridines en pseudo-uridines (Ys) est l'une des modifications de l'ARN ribosomique les plus fréquentes. Chez les eucaryotes, les sites de pseudouridylation sont spécifiés par l'appariement de séquences de ciblage spécifiques que l'on trouve dans une classe particulière de petits ARN nucléolaires, les snoRNA à boites H/ACA. L'ARNr de levure contient 44 Ys, mais, quand nous avons débuté ce travail, on ignorait les snoRNA spécifiant 15 de ces sites. Cela suggérait qu'il restait un nombre important de snoRNA H/ACA à identifier. Pour aborder cette question, nous avons identifié exhaustivement les ARN associés aux protéines Gar1p et Nhp2p qui sont spécifiques des snoRNA H/ACA. Ceci a été réalisé en couplant une méthode de purification par double affinité (méthode TAP) et l'hybridation des ARN associés aux complexes purifiés sur des puces à ADN génomiques. Nous avons ensuite recherché de manière systématique le rôle des snoRNA, précédemment connus ou nouveaux, dans la modification des pseudouridines des ARNr. Ceci nous a permis d'identifier les snoRNA impliqués dans chacune des pseudouridylations de l'ARNr chez la levure. On peut donc maintenant affirmer que les 44 Y s des ARNr sont spécifiées par 28 snoRNA. Enfin, mis à part snR30, tous les snoRNA H/ACA de levure sont impliqués dans la pseudouridylation de l'ARNr (Torchet et al., 2005). Ce travail a été réalisé en collaboration avec Frédérique Devaux à l'ENS Paris.

Dégradation nucléaire des ARN et contrôle de l'expression génique.

Il est admis de manière assez générale que la fraction du génome qui s'exprime correspond à la fraction transcrite. Cependant, nous avons identifié plusieurs régions intergéniques, en apparence non-codantes dans le génome de S. cerevisiae, qui sont transcrites par l'ARN polymerase II. Cela pourrait suggérer que la fraction exprimée du génome est plus grande que ce qui avait été supposé précédemment. En réalité, nous avons montré que les ARN issus de ces régions sont très rapidement dégradés par l'action conjuguée de l'exosome nucléaire et d'une nouvelle poly(A) polymerase. Cette nouvelle activité de polyadénylation est portée par un complexe nucléaire constitué de la protéine de Trf4 associée à l'une des protéines fixant l'ARN, Air1 ou Air2. Cette dégradation exonucléasique, assistée par l'activité poly(A) polymerase (à l'image de ce qui est observé chez les bactéries) est également responsable de la dégradation de plusieurs transcrits Pol I ou Pol III. Nos observations montrent qu'il existe un mécanisme nucléaire de contrôle de qualité qui restreint l'expression de l'information génétique inappropriée (Wyers et al., 2005; La Cava et al., 2005). Ces travaux ont été réalisés en collaboration avec les laboratoires de Domenico Libri et Bertrand Séraphin au CNRS à Gif-sur-Yvette et le laboratoire de David Tollervey à l'Université d'Edinburgh.

L'assemblage des complexes préribosomiques

En 2005, nous avons poursuivi l'étude de la dynamique d'assemblage des facteurs préribosomiques ainsi que la caractérisation de trois facteurs protéiques impliqués dans la biogenèse de la grande sous unité préribosomique. 

En collaboration avec la plateforme protéomique, nous déterminons, à l'aide de méthodes de spectrométrie quantitative (SILAC et iTRAQ), la composition de différents complexes préribosomiques marqueurs d'étapes spécifiques de la voie de biogenèse. Ces complexes sont purifiés par la méthode de TAP. Cette analyse nous permet de déterminer des groupes de facteurs préribosomiques engagés soit dans des étapes précoces, soit tardives de la biogenèse.

En 2005, nous avons mis particulièrement l'accent sur l'étude des étapes tardives de la biogenèse de la particule 60S. Nous avons caractérisé un nouveau facteur pré-60S cytoplasmique, Ybr267w/Rei1, impliqué dans ces étapes tardives. En absence de ce facteur, le réimport dans le noyau de trois facteurs navettes au moins est affecté : Arx1, Tif6 et un nouveau facteur, Yjl122w/Alb1. En l'absence de Rei1, l'accumulation cytoplasmique d'un petit complexe contenant Arx1 et Alb1 inhibe le décrochage de Tif6 des particules préribosomiques et son recyclage vers le noyau. Tif6 étant précédemment décrit comme un facteur inhibant l'association entre la petite et la grande sous unité ribosomique, nous proposons un modèle selon lequel Rei1 coordonne la dissociation et le recyclage des derniers facteurs pré-60S, permettant l'entrée des grandes sous unités ribosomiques matures dans la traduction (Lebreton et al. sous presse dans J.C.B.).

Mots-clés: ARN, Saccharomyces cerevisiae, dégradation des ARN, ARN non-codant, maturation des ribosomes


Rapports d'activité 2005 - Institut Pasteur
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