Unité: Génétique des Déficits Sensoriels - INSERM (U587)

Responsable: Christine PETIT

Les recherches menées dans l'unité de Génétique des Déficits Sensoriels ont deux objectifs très liés l'un à l'autre : (i) identifier les gènes dont le déficit est à l'origine d'une perte de l'acuité auditive chez l'homme, (ii) découvrir des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent le développement et le fonctionnement de la cochlée, organe de l'audition des mammifères. Après avoir utilisé les gènes de surdité comme points d'entrée dans une série de "modules" développementaux et/ou fonctionnels, le laboratoire met aujourd'hui en œuvre des approches complémentaires, tout particulièrement pour accéder aux bases moléculaires du fonctionnement de la touffe ciliaire des cellules sensorielles, l'organelle de la transduction mécano-électrique auditive.

Comprendre les mécanismes qui sous-tendent le fonctionnement des systèmes sensoriels est un objectif auquel l'étude des dysfonctionnements héréditaires de ces systèmes peut contribuer depuis que les outils d'analyse génétique, puis génomique, ont été développés.

Au début des années 1990, notre choix s'est porté sur l'étude des surdités héréditaires humaines pour deux raisons : (1) elles constituaient alors un domaine inexploré de la pathologie sensorielle héréditaire, (2) elles devaient permettre d'aborder les bases moléculaires du développement et du fonctionnement de la cochlée (organe récepteur de l'audition), alors totalement inconnues.

Depuis 1995, nous avons identifié les gènes responsables de trois formes du syndrome de Usher de type I (USH1B, USH1C, USH1G), qui associe une surdité neurosensorielle profonde et une rétinopathie pigmentaire évoluant vers la cécité. Nous avons également identifié les gènes défectueux dans huit formes de surdité isolée récessive (DFNB2, DFNB9, DFNB16, DFNB18, DFNB21, DFNB22, DFNB31 et DFNB59), deux formes de surdité isolée dominante (DFNA2, DFNA3), des syndromes branchio-oto-rénal et branchio-otologique, et contribué à l'identification de plusieurs autres.

Par des approches expérimentales complémentaires, nous avons obtenu un ensemble de résultats sur la fonction des protéines codées par ces gènes. La plupart de ces protéines interviennent dans l'un des quatre processus suivants : (1) la structure de la membrane tectoriale, membrane acellulaire qui couvre l'épithélium sensoriel auditif et qui participe à la transmission de l'énergie de l'onde sonore à la touffe ciliaire des cellules sensorielles, (2) le développement de la touffe ciliaire, structure réceptrice du son composée d'un ensemble de microvillosités rigides, les stéréocils, et qui abrite la machinerie de transduction mécano-électrique, (3) le fonctionnement de la synapse des cellules sensorielles (synapse à "rubans"), et (4) la communication entre cellules par les jonctions communicantes.

Par ailleurs, nous avons entrepris une étude génétique de la presbyacousie, surdité neurosensorielle progressive du sujet d'âge mûr qui prédomine sur les fréquences aigües, et qui pourrait concerner plus de la moitié des individus de plus de 70 ans. Sa pathogénie est très mal connue, et la part des facteurs génétiques, probablement sous-estimée, reste à évaluer. L'étude a pour objectif d'identifier les gènes les plus fréquemment impliqués, grâce à l'étude d'un grand nombre de familles concernées dont le recrutement est en cours.

Développement de la touffe ciliaire .

Quatre composants de la touffe ciliaire ont été identifiés : la myosine VIIa, la whirline (voir photo), l'harmonine et la stéréociline. Les mutations des gènes codant pour la myosine VIIa et l'harmonine sont responsables d'un syndrome de Usher de type I (formes USH1B et USH1C), plus rarement d'une surdité isolée. Harmonine et whirline sont deux molécules à domaines PDZ, protéines sous-membranaires qui organisent des complexes protéiques. La queue des myosines non conventionnelles, telle que la myosine VIIA, se lie à des protéines sur lesquelles la force motrice de la myosine s'exerce. Les structures auxquelles ces protéines sont associées sont alors mises sous tension, et peuvent même dans certains cas se déplacer. Dans le but de comprendre le rôle de la myosine VIIa, une étude de ses ligands a été entreprise. Elle nous a permis d'identifier une nouvelle molécule transmembranaire ubiquitaire des jonctions intercellulaires d'adhérence, la vézatine, appartenant au même complexe que la E-cadhérine, et ainsi de proposer un rôle pour la myosine VIIa dans l'adhérence entre les cellules. Un autre ligand de cette myosine se lie à rab27, présent à la surface des mélanosomes, expliquant ainsi l'anomalie de position des mélanosomes dans les cellules de l'épithélium pigmentaire de la rétine chez les patients atteints du syndrome USH1B. Enfin, nous avons montré que les isoformes b de l'harmonine, présentes dans la touffe ciliaire en développement, d'une part se lient aux filaments d'actine et induisent leur regroupement en faisceaux, et d'autre part interagissent avec la cadhérine-23 et la protocadhérine-15, deux autres protéines impliquées dans le syndrome de Usher de type I (formes USH1D et USH1F) et qui forment des liens interstéréociliaires transitoires. Ainsi, quatre protéines défectueuses dans quatre formes du syndrome de Usher de type I concourent à un réseau d'interactions moléculaires, qui contribue à la cohésion de la touffe ciliaire en croissance en solidarisant ses stéréocils par l'ancrage des liens qui les connectent aux filaments d'actine formant le cytosquelette de chaque stéréocil. Ce réseau a été enrichi de la protéine SANS (protéine du cytosquelette composée d'un domaine SAM et de 3 répétitions ankyrine), défectueuses dans une autre forme du syndrome de Usher de type I (USH1G). SANS interagit avec l'harmonine et la myosine VIIa. Sa localisation, sous la touffe ciliaire, dans une région riche en vésicules, indique que SANS pourrait contrôler le trafic de la myosine VIIa et de l'harmonine vers la touffe ciliaire. Enfin, nous avons montré que l'usherine, une protéine transmembranaire à long domaine extracellulaire, dont le déficit est responsable du syndrome de Usher de type II (USH2A), est elle aussi vraisemblablement impliquée dans la constitution de liens interstéréociliaires (liens basaux) au cours de la différenciation de la touffe ciliaire. Par ailleurs, nous avons établi que la whirline, dont le déficit est responsable de la surdité DFNB31, se lie à la myosine XV avec laquelle elle est colocalisée à l'extrémité des stéréocils en croissance (voir photo). Enfin, nous avons identifié une nouvelle protéine transmembranaire des cellules ciliées, PHR1, qui se lie à la myosine VIIa ainsi qu'à la myosine 1c, et pourrait donc jouer un rôle dans le processus d'adaptation de la transduction mécano-électrique.

Synapses des cellules sensorielles .

Dans une étude collaborative, nous avons montré que la surdité DFNA2 est due à un défaut du canal potassique KCNQ4, exprimé principalement par les cellules ciliées externes (dont la fonction essentielle est l'amplification de la stimulation sonore) et les neurones des voies auditives centrales. Surtout, l'identification du gène responsable d'une autre forme de surdité récessive, DFNB9, nous a conduit à découvrir l'otoferline, une protéine transmembranaire de la même famille que les dysferlines, qui est associée aux vésicules synaptiques des cellules ciliées internes (authentiques cellules sensorielles auditives). L'obtention de souris génétiquement déficientes en otoferline et leur caractérisation nous a permis de montrer que cette protéine joue un rôle crucial dans la sécrétion des vésicules synaptiques par ces cellules.

Jonctions communicantes .

La connexine26 est défectueuse dans une forme de surdité récessive, DFNB1, dont nous avons montré qu'elle rend compte, à elle seule, d'environ un tiers des cas de surdité de l'enfant. Les deux réseaux cellulaires cochléaires formés par des jonctions communicantes, le réseau épithélial et le réseau fibrocytaire, expriment la connexine26 et la connexine30, dont le déficit conduit également à une surdité. Compte tenu de la fréquence de la forme de surdité DFNB1, nous nous sommes engagés dans l'étude de sa pathogénie. L'inactivation ubiquitaire du gène qui code pour la connexine26 (Cx26) est létale chez la souris. Nous avons donc réalisé une inactivation conditionnelle de Cx26 dans le réseau épithélial, et avons analysé le phénotype des souris mutantes, ainsi que celui de souris chez lesquelles le gène qui code pour la connexine30 (Cx30) avait été inactivé de façon ubiquitaire. Dans les deux cas, une mort par apoptose des cellules de l'épithélium sensoriel auditif est observée dès le début de la 3ème semaine postnatale, c'est à dire peu après que les souris sauvages ont commencé à entendre. De surcroît, le potentiel endocochléaire, une différence de potentiel transépithéliale entre compartiments endolymphatique et périlymphatique, qui apparaît normalement dès la 2ème semaine de vie, est absent chez les souris Cx30-/-. Ce résultat nous a permis de conclure au rôle essentiel de la connexine30 dans la strie vasculaire, site de production du potentiel endocochléaire.

Ces résultats ont été obtenus grâce à la synergie des activités des différents membres du laboratoire. Les banques d'ADNc soustraites générées par certains ont aussi servi à d'autres pour isoler des gènes de surdité ; elles ont été la source de promoteurs utilisés par plusieurs pour générer des inactivations conditionnelles de gènes dans l'oreille. Compte tenu de la structure complexe de l'oreille interne, les connaissances en histologie et en embryologie de certains ont été précieuses pour permettre le passage de l'isolement des gènes responsables de surdité à l'étude de la pathogénie des formes de surdité correspondantes. Un véritable transfert de connaissances entre spécialistes de biologie moléculaire, embryologistes et médecins ORL, s'est rapidement produit. L'étude de la structure des protéines et l'étude électrophysiologique de la transduction mécano-électrique dans la touffe ciliaire des cellules sensorielles de la cochlée de souris est depuis peu venue s'ajouter aux compétences techniques de notre laboratoire. Un dialogue étroit entre ceux qui cherchent de nouveaux gènes impliqués dans la surdité et ceux qui travaillent à définir les réseaux d'interaction moléculaire où s'insèrent les produits des gènes déjà identifiés, a été source d'idées et de résultats pour les uns et les autres. L'articulation constante avec la clinique a permis de mettre en évidence la fréquence de l'atteinte du gène de la connexine26, d'apporter la première description clinique d'une forme génétique de surdité isolée et surtout d'évaluer les implications médicales de nos travaux. L'activité de conseil génétique pour les familles comportant des individus sourds s'est considérablement améliorée.

Légende de la photo :

La whirline, protéine sous-membranaire à domaines PDZ, dont l'atteinte est responsable de la forme DFNB31 de surdité récessive, est détectée par un anticorps spécifique (coloration rouge) dans les cellules sensorielles de l'oreille d'une souris de 12 jours post-natals. La protéine est présente à l'extrémité des stéréocils pendant leur différenciation et joue un rôle essentiel dans la croissance de la touffe ciliaire. Les stéréocils sont colorés en vert par la phalloïdine (couplée à un fluorophore), qui se lie spécifiquement aux filaments d'actine.

Mots-clés: Audition, Surdités, Physiologie sensorielle, Déficits sensoriels, Génétique humaine, Biologie cellulaire, Electrophysiologie


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