Unité: Génétique de la Différenciation - URA 2578 CNRS

Responsable: Mary C. Weiss

L'Unité s'intéresse aux mécanismes impliqués dans la régulation de l'expression de gènes hépatiques et dans les rôles de facteurs de transcription nécessaires à l'établissement et au maintien de cette différenciation, en particulier, HNF4α. De plus, nous établissons de nouveaux modèles de la différenciation hépatique. Enfin, nous cherchons à définir des molécules spécifiquement induites lors de l'infection de l'hépatocyte par des sporozoïtes de Plasmodium berghei.

Rôles et régulation de HNF4α (N. Briançon, A. Bailly, C. Rachez)

Nos efforts sont concentrés sur l'étude d'HNF4α, un récepteur nucléaire qui est un facteur clef pour la différenciation hépatique. Le gène HNF4α possède deux promoteurs alternatifs dont l'usage est régulé au cours du développement du foie. (D'autres isoformes, comme HNF4α2 et α8 que nous ne discutons pas ici, résultent des événements d'épissage alternatif). Le promoteur distal P2 dirige l'expression de l'isoforme HNFα7, et il est utilisé  au cours du développement du foie alors que le transcrit HNF4α1 issu du promoteur proximal P1 est toujours la forme majoritaire dans le foie et est quasi-exclusif dans le foie adulte.

Pour mieux comprendre les différences d'activité des isoformes HNF4α1 et HNF4α7, les deux domaines de transactivation connus pour les récepteurs nucléaires ont été analysés par tests d'interactions in vitro et de co-transfection ex vivo. Dans le cas de HNF4α7 l'AF-1 est dépourvu d'activité alors que celui de HNF4α1 est d'une part actif dans un essai simple hybride et d'autre part son activité est augmentée par interaction avec GRIP et CBP. Par contre, pour les deux protéines l'AF-2 est capable de médier l'interaction avec GRIP-1, p300 et le corépresseur SMRT. Cependant, la répression médiée par SMRT est moins importante pour HNF4α7 que pour HNF4α1. Finalement les deux isoformes, en association avec SMRT, sont capables de recruter HDAC 1 et 4, et quand les trois molécules sont associées, une plus grande quantité de HNF4α1 (mais pas de HNF4α7) est fixée. De plus, dans un test de transfection en présence d'un inhibiteur de HDACs une augmentation dramatique d'un rapporteur est observée pour HNF4α1 mais pas HNF4α7. Ces résultats suggèrent que HNF4α1 est plus sujet à une régulation par interactions avec les coactivateurs et corepresseurs que HNF4α7.

Les rôles des isoformes α1 et α7 de HNF4 sont analysés par la création de mutants chez la souris où une seule des isoformes (y inclut les isoformes issues d'epissage alternatif) est exprimée mais sous le contrôle des deux promoteurs. Dans ces conditions, la quantité totale de protéines HNF4α devrait être constante pour tous les génotypes. Les souris " alpha-1 only " et " alpha-7  only " sont viables et fertiles, ce qui indique que les deux isoformes sont redondantes fonctionnellement. Cependant, les souris " alpha-7 only " démontrent des défauts subtils de métabolisme lipidique. De plus, nous avons pu identifier des gènes cibles de HNF4α qui exigent l'AFl fonctionnel pour leur expression comme ApoAlV et Constitutive Androstane Receptor (CAR). Ces animaux knock-in permettent un test direct du rôle du domaine AF1, car seul alpha1 possède un domaine fonctionnel AF1.

Dans le but de caractériser les aspects moléculaires associés aux différences d'activité entre les isoformes HNF4α1 et HNF4α7, nous avons initié une approche protéomique pour rechercher s'il existe des protéines associées de manière différentielle à chaque isoforme d'HNF4α. Cette approche reproduit une stratégie employée pour la caractérisation de corégulateurs transcriptionnels du récepteur de l'acide rétinoïque RARα, et qui a permis l'identification de nouveaux cofacteurs du récepteur. Les travaux effectués sur les corégulateurs du RARα, initiés dans une unité distincte, sont également poursuivis et finalisés dans le laboratoire. 

L'analyse du promoteur P2 a révélé qu'il est régulé surtout par des sites de liaison pour HNF1 et HNF6/Oc2. Pour comprendre la régulation de ce promoteur, les souris knock-in ont été très utiles, car dans les " alpha-7 only ", le promoteur P2 est sur-exprimé dans le foie adulte, ce qui implique que HNF4α1 est un répresseur de P2, se liant indirectement au promoteur. Ces résultats expliquent l'observation inattendue que le site hypersensible majeur du promoteur P2 est toujours présent dans le foie adulte, bien que ce promoteur ne s'exprime presque pas à ce stade.

Lignées de cellules bipotentielles hépatiques (H. Strick-Marchand, C. Deschatrette, T. Imaizumi-Scherrer, D. Faust, G. Hayhurst, G. Yeoh)

Nous avons poursuivi l'étude des lignées bipotentielles obtenues à partir de foies embryonnaires de souris. Alors que les premières lignées ont été obtenues à partir de souris exprimant un transgène, nos tentatives récentes de les obtenir à partir de souris non-transgéniques ont reussi. Ainsi, nous disposons de lignées hépatiques bipotentielles (BMEL : Bipotential Mouse Embryonic Liver) à partir d'un grand nombre de souches de souris. Les méthodes pour induire leur différenciation en hépatocytes ou en cholangiocytes ont été améliorées. Des fonctions hépatocytaires telles que les apolipoprotéines, l'albumine, l'AFP, et les enzymes alcohol deshydrogénase et aldolase B sont efficacement induites après culture pour cinq jours en forme d'agrégats. En revanche, la culture en Matrigel permet non seulement l'induction d'une série de marqueurs de cholangiocytes et de cellules ovales, tels que CD34, c-kit, integrine b4, connexines et GGTIV, mais aussi une morphogenèse en structure appelée unité de canaux biliaire. Grâce à un contrat NIH " Genome Anatomy Projet " en collaboration avec le laboratoire de Gretchen Darlington (www.scgap.org), l'analyse de gènes exprimés par ces lignées en culture basale ainsi qu'après induction de la différenciation a été réalisée avec des puces Affymetrix.

La facilité d'obtention de ces lignées nous permet maintenant de les dériver à partir de foie adulte ainsi que des souris dont des gènes importants pour le développement du foie ont été mutés par recombinaison homologue dans des cellules ES. Les lignées BMEL déficientes ou non dans un facteur de transcription donné nous permettra de clarifier leurs rôles dans le maintien de la bipotentiallité et dans l'exécution des programmes de différenciation en hépatocytes et cholangiocytes.

De plus ces lignées sont en cours d'analyse pour leur capacité à participer à la régénération hépatique en formant des hépatocytes matures et des cholangiocytes. Nous avons utilisé comme modèle de régénération hépatique la souris transgénique Alb-uPA où des quantités excessives de uPA induisent une dégénérescence hépatique qui est résolue grâce à l'excision du transgène dans quelques hépatocytes. En collaboration avec Dina Kremsdorf et Seban Morosan (INSERM U370 à l'Hôpital Necker) et Pierre Charneau (IP), nous avons injecté dans des jeunes souris Alb-uPA/SCIDdes cellules BMEL-GFP. Apres quelques semaines, des îlots en prolifération d'hépatocytes et de ducts biliaires GFP-positifs sont observés. Les cellules de ces îlots expriment H2Kk, caractéristique des cellules donneuses et sont négatives pour H2Dd qui est exprimé par la souris receveuse. Ceci démontre que les îlots de cellules BMEL-GFP ne sont pas le résultat de fusion avec les hépatocytes de l'hôte. Les cellules BMEL-GFP expriment de façon appropriée une série de marqueurs de l'hépatocyte et des cholangiocytes. Ainsi, les cellules BMEL sont bipotentielles in vivo, car les cellules injectées ont le même comportement que les cellules hépatiques endogènes de la souris. De plus, des lignées similaires ont pu être isolées à partir de foie sain de souris adultes CS7Bl6 : ces lignées clonales sont également bipotentielles in vitro et in vivo.

Mots-clés: Différenciation hépatique, Facteurs de transcription enrichis dans le foie, HNF4 isoformes, corégulateurs, cellules souches hépatique bipotentielles, repeuplement du foie


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