Unité: Cellules souches et développement - CNRS URA 2578

Responsable: Tajbakhsh Shahragim

Nos recherches sont principalement centrées sur la façon dont les cellules souches du muscle squelettique sont maintenues comme telles, et comment leur destin est progressivement defini pendant leur développement prénatal et post-natal. Nous utilisons des souris génétiquement modifiées pour comprendre les rapports épistatiques entre Pax3, Pax7, Myf5, Mrf4 et MyoD. Ces facteurs de transcription clés agissent sur les cellules qui se divisent de façon symétrique ou asymétrique pour d'abord établir et ensuite maintenir le programme du muscle squelettique à la fois dans l'embryon et au stade post-natal. Nous proposons un modèle de lignage cellulaire et développemental dans lequel ont lieu ces événements.

Régulation génétique et cellulaire de l'identité du muscle squelettique

Lina Kassar-Duchossoy*, Ellen Giacone*, Aurélie Jory, Philippos Mourikis, Barbara Gayraud-Morel, Ramkumar Sambasivan, Danielle Gomès*, Gérard Dumas. (*quitté le laboratoire en 2005)

Le développement du muscle squelettique est un excellent modèle pour l'étude de l'acquisition du destin cellulaire, de la transition de la cellule souche en cellule différenciée ainsi que de l'auto-renouvellement de cellules souches et de l'homéostasie tissulaire. Les gènes de régulation clés de la famille "paired-box/homeodomain" Pax3 et Pax7 tout comme les facteurs de régulation myogénique à motif bHLH Myf5, MyoD, Mrf4 et Myogénine ont été identifiés. La régulation génétique du muscle squelettique s'est révélée complexe. Par exemple les différences spécifiques propres à la tête ou au corps se traduisent par des relations épistatiques distinctes, étant donné que Pax3 et Myf5 agissent en amont de MyoD dans l'embryon (Tajbakhsh et al. 1997). Ces résultats on établi une hiérarchie génétique dans les muscles dérivés du somite dans l'embryon. Plus récemment, nous avons identifié Mrf4 comme étant un troisième gène déterminant de ce lignage dans l'embryon (Kassar-Duchossoy et al. (2004), en collaboration avec D. Rocancourt, M. Buckingham, Institut Pasteur). Nous pensons maintenant que la régulation génétique du muscle squelettique dépend de la localisation anatomique et qu'elle correspond au "patterning" embryologique . En effet de nouvelles mutations au niveau du locus Myf5 combinées avec des souris mutantes en MyoD (Kassar-Duchossoy et al., 2004) ont démontré que la myogénèse peut être découplée dans l'espace et dans le temps (Figure 1). Nous pensons que les cellules souches naissent de façon génétiquement distincte dans les différentes régions de l'embryon et que les relations épistatiques entre Pax3, Myf5, Myf4 et MyoD peuvent être modulées dans différentes régions de l'embryon au cours du développement (Tajbakhsh, 2005). Notre travail actuel tend à clarifier cette épistasie et à corrréler la régulation génétique de la myogénèse avec le lignage du muscle squelettique. Un ordre hiérarchique définissant les populations de cellules dans le muscle squelettique a été proposé (Tajbakhsh, 2003,2005) et nous avons des données génétiques qui soutiennent ce modèle (Kassar-Duchossoy et al., 2005). Alors que Pax3 joue un rôle prédominant dans la myogénèse au stade prénatal, Pax7 joue un rôle clé dans les cellules satellites adultes. Nous étudions le rôle de ce gène en association avec Myf5, dans l'embryon et dans les cellules satellites adultes. Nous avons créé de nouveaux allèles dans ces loci pour étudier l'identité et l'auto-renouvellement cellulaire ainsi que le rôle joué par ces gènes dans les cellules souches et les progénitrices aux stades prénatal et post-natal. Notamment au stade prénatal, les cellules souches/progéniteurs du muscle ont besoin du muscle squelettique tout comme de l'expression de Pax7 pour survivre.

Nous avions précédemment montré qu'en l'absence de Myf5, les progéniteurs du muscle restaient multipotents et pouvaient changer de destin dans l'embryon en fonction de leur environnement. Nous avons ainsi créé par knock-in différents allèles dans le locus de Myf5 pour suivre ces études. Outre la mise en évidence des régulations génétiques qui gouvernent la myogénèse squelettique, ces souris vont permettre la caractérisation moléculaire et cellulaire des cellules souches/progénitrices du muscle squelettique. Par exemple, les souris knock-in Myf5GFP nous ont permis d'isoler par FACS des cellules satellites post-natales destinées à l'étude de greffes chez des souris immuno-déprimées. Ces greffes, de quelques milliers de cellules satellites, se sont révélées particulièrement efficaces (en collaboration avec A. Cumano, J. Di Santo, V. Mouly, Institut de Myologie - Paris).

Dans une perspective développementale et embryologique, nous nous intéressons également à la ségrégation des lignages cellulaires dans le somite. Nous étudions particulièrement les perturbations constatées au niveau des côtes distales chez des souris mutées pour le gène Myf5. Il s'agit de mettre en évidence si les progéniteurs des côtes distales proviennent du sclérotome ou du dermomyotome. Etant donné que Myf5 n'est pas exprimé dans le sclérotome, nous avons cherché les causes des désordres affectant les côtes distales chez ces mutants. Nous avons examiné un certain nombre d'allèles dans le locus de Myf5 et il apparaît que la régulation de ce locus joue un rôle important dans la ségrégation des cellules progénitrices dans le somite.

Identification et caractérisation des cellules souches du muscle squelettique

Vasily Shinin, Barbara Gayraud-Morel, Ramkumar Sambasivan, Fabrice Chrétien

Récemment nous avons défini les différents états cellulaires qui caractérisent la progression myogénique des cellules souches aux cellules différentiées (Figure 2, Kassar-Duchossoy et al. 2005 ; Tajbakhsh, 2005). Utilisant ce modèle comme guide, nous examinons ce qui distingue ces différents états cellulaires. Les facteurs de régulation myogéniques (MRFs) agissent au niveau des cellules progénitrices pour produire des myoblastes. Pax3 et Pax7 agissent au niveau des cellules souches et donnent naissance aux progéniteurs au moins dans l'embryon. Les événements moléculaires et cellulaires qui guident la progression myogénique jusqu'à l'état de cellule différenciée sont en cours d'étude. Durant la régénération du muscle adulte, les cellules satellites quiescentes s'activent et se divisent pour générer des myoblastes précurseurs qui peuvent fusionner avec les fibres en régéneration. Ce modèle peut être imité en culture où l'activation et l'autorenouvellement des cellules satellites est étudié. Une des stratégies que nous avons utilisée pour marquer les cellules souches du muscle de l'adulte comprend des expériences "pulse-chase" avec BrdU. Par cette approche, des cellules souches du muscle ont déjà été identifiées dans leur niche. Nous avons trouvé qu'une sous-population de cellules satellite sont "label retaining" montrant de ce fait l'hétérogénéité de cette population. Il est intéressant de noter que les cellules BrdU "label retaining" ségrègent le marquage dans une seule cellule fille durant la division des cellules, à la fois in vivo et in vitro. Cette observation se rapproche du modèle de ségregation "immortelle" de l'ADN (Figure 3) pour les cellules souches proposée par Cairns (Nature, 1975).

L'auto-renouvellement des cellules souches peut se faire par division asymétrique des cellules. Nos études utilisant le facteur Numb, un déterminant du destin cellulaire, révèlent que l'asymétrie fonctionne dans les myoblastes dérivés des cellules satellites (Figure 3) et nous avons également démontré ceci par videomicroscopie sur cellules vivantes. Nous envisageons d'étendre ces recherches à l'organisme et d'utiliser une approche de transgénèse pour manipuler le destin des cellules souches, dans le but de modifier les décisions de l'identité cellulaire et d'identifier les facteurs clé impliqués dans cette décision importante. Prises dans l'ensemble, ces études, et celles décrites plus haut, nous conduisent à proposer qu'une sous-population de cellules satellites ont les propriétés des cellules souches.

Légendes des photos :

Où sont localisées les cellules souches du muscle et comment se renouvellent-t-elles ?

Figure 1.  Régulation génétique globale des gènes Pax et MRF dans le muscle squelettique. La formation du muscle squelettique pourrait être découplée dans le temps et dans l'espace en utilisant différentes combinaisons de mutants génétiques.

Figure 2. Identification d'une population de souches cellules myogéniques Pax3+/Pax7+. Les mutants Myf5GFP-P/GFP-P:MyoD-/- ont permis de bloquer l'engagement des cellules dans le lignage musculaire. En l'absence de muscles squelettiques foetaux, une population de cellules souches est identifiée par l'expression de Pax7 (A). Ces cellules (rouge) sont intimement associées aux fibres embryonnaires exprimant la Desmine (vert). Les noyaux sont marqués par le Hoechst (bleu). Ces cellules souches sont détectées dans tous les muscles du tronc et des membres durant le développement prénatal. Ces expériences ont abouti à une définition des différents états cellulaires (B).

Figure 3. La division asymetrique dans les cellules primaire du muscle. A) la ségregation asymetrique de proteine Numb endogène pendant la mitose. B) marquages par anticorps des cellules en division (symetrique, haut ; asymetrique, bas) montrant la segregation de l'ADN BrdU+ dans les cellules filles après pulse-chase avec le BrdU.

Mots-clés: cellules souches, division cellulaire asymétrique, muscle squelettique, somites, cellules satellites, Myf5, MyoD, Mrf4, Pax3, Pax7, Numb


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