Unité: Collection de l'Institut Pasteur

Responsable: BIZET Chantal

La Collection de l'Institut Pasteur (CIP) a pour mission d'assurer la maintenance et l'enrichissement de la collection des bactéries de l'Institut Pasteur, la production d'un catalogue, la diffusion d'informations (caractères phénotypiques, propriétés particulières, pouvoir pathogène...) concernant les souches distribuées, le développement d'une recherche sur l'identification, la taxonomie, la conservation des bactéries, la participation aux enseignements de l'Institut Pasteur. La Collection a été certifiée selon le référentiel ISO 9001 version 2000 en juin 2001. Partie intégrante du Centre de Ressources Biologiques de l'Institut Pasteur, elle participe à plusieurs projets internationaux et nationaux pour la mise en place de Centres de Ressources Biologiques.

1. Gestion du stock de souches

La Collection dispose aujourd'hui de plus de 8 800 souches inscrites au catalogue. Chaque année, de nouvelles souches sont incorporées dans la collection (environ 300), provenant soit de chercheurs de l'Institut Pasteur, soit de collections étrangères selon des accords d'échanges entre les collections, soit de dépôts de souches nouvellement décrites après contact avec des chercheurs étrangers ou français. La collection regroupe également des plasmides, des transposons, des souches hôtes et des sondes. Des suspensions de spores (genres Bacillus et Clostridium) titrées sont disponibles. Le dédoublement de la collection permet de conserver les souches dans 2 endroits différents et par 2 techniques différentes (lyophilisation et congélation à - 80°C, ou congélation dans l'azote liquide et à - 80°C pour les souches qui ne supportent pas la lyophilisation).

2. Contrôle en routine des souches de la CIP

a) Electrophorèse des protéines totales et chimiotaxonomie

Ce laboratoire contribue aux développements de méthodes d'identification bactérienne par l'analyse fine des constituants de la paroi bactérienne : lipides, peptidoglycane, sucres polymères... et protéines totales. Les principales techniques utilisées sont la chromatographie planaire et ses dérivés ainsi que l'électrophorèse en gel discontinu. Les résultats sont exploités par un traitement informatique à l'aide de logiciels spécifiques.

Plusieurs banques de données sont en cours d'enrichissement et comprennent notamment les profils protéiques (environ 4000 souches).

b) Ribotypage

Une base de données d'environ 900 profils obtenus par ribotypage a été réalisée. Les travaux de ce laboratoire trouvent leur application d'une part dans le contrôle des souches de la Collection et d'autre part dans l'expertise de souches pour le compte de laboratoires industriels.

c) Caractérisation moléculaire

Toutes les souches nouvellement incorporées à la collection sont identifiées par séquençage du gène codant pour l'ARNr 16s. Progressivement les anciennes souches seront également séquencées sur ce gène.

3. Assurance Qualité

L'ensemble des activités de la CIP est formalisé par écrit au sein d'un système documentaire architecturé et adapté à l'organisation de la CIP. Les opérations sont enregistrées. Les dispositions mises en place sont en permanence appliquées et améliorées. Régulièrement des audits internes sont réalisés afin d'évaluer les éventuels écarts entre " ce qui est fait et ce qui est écrit ". Des indices Qualité sont établis à partir des incidents du laboratoire relevés et des réclamations des clients. Des actions correctives et préventives sont déclenchées si nécessaire. La certification (norme ISO 9001) est attribuée pour une période de 3 ans. Mais, chaque année, elle doit être reconduite suite à un audit de suivi.

La CIP a renouvelé sa certification dans la cadre de la création du CRBIP en 2005 selon le référentiel ISO 9001 version 2000 et les méthodes utilisées par la CIP pour l'identification sont en cours d'accréditation selon la norme 17025.

4. Le Centre de Ressources Biologiques de l'Institut Pasteur (CRBIP)

L'Institut Pasteur est sans nul doute l'institution française regroupant, sur un même site, le plus grand nombre de collections spécialisées de microorganismes (bactéries, champignons, virus, parasites). Dans la majorité des cas ces collections sont entretenues au sein de laboratoires de recherche. Seules trois de ces collections sont " ouvertes ", c'est-à-dire qu'elles distribuent, contre paiement, des souches aux laboratoires d'analyse,

industries pharmaceutiques, laboratoires de recherche, établissements d'enseignement qui en font la demande. Ces trois collections sont toutes répertoriées dans le World Data Centre for Microorganisms

(WDCM). Il s'agit de : la collection de l'Institut Pasteur (CIP), la collection des Cyanobactéries (PCC) et la collection des Champignons (UMIP).

Avec la création du Centre de Ressources Biologiques de l'Institut Pasteur (CRBIP), il s'agit :

1) d'élargir l'éventail des souches de micro-organismes mises à la disposition de la communauté scientifique et des industriels et pour lesquelles les opérations d'incorporation, de production, de contrôle/caractérisation (incluant la caractérisation moléculaire), de mise en conservation, de stockage et de distribution répondent aux exigences de l'assurance Qualité et des règlements en vigueur, notamment en matière de sécurité.

2) d'élaborer et mettre en production le logiciel correspondant de gestion de collection (logiciel utilisable par toutes les collectons appelées à être partie prenante dans le CRBIP). Un tel logiciel devait permettre de gérer toutes les données se rapportant à différents types de micro-organismes. Ces données concernant la taxinomie, la nomenclature, les références bibliographiques-clefs, les caractéristiques morphologiques, physiologiques, physiopathologiques et moléculaires, les informations pratiques (milieu usuel, température optimale de croissance…), ainsi que la gestion de la production, du stockage et de la distribution.

Actuellement, deux collections ouvertes ont intégré le CRBIP, la CIP et l'UMIP, des bactéries en provenance des CNR de la Leptospirose, de la coqueluche et autres bordetelloses, des Listeria et des Mycobactéries ainsi que de l'Unité de Pathogénie Bactérienne des Muqueuses et des sélections de virus (Rétrovirus, Flavivirus et Lyssavirus) ont été incorporés au CRBIP, après contrôle de leur viabilité et de leur identité et constitution d'un stock minimal. Au total le CRBIP compte près de 12000 souches de microorganismes.

Parallèlement le CRBIP contribue à la sauvegarde de collections en difficulté (collection de staphylocoques de l'ancien Centre National de Référence, collection des anaérobies de M. Prévot, collection de Maurice Hofnung, collection de venins et anti-venins etc.)

Tout logiquement, l'accent a été mis sur son organisation informatique, avec l'élaboration d'un logiciel de gestion des collections (ARPAS) modulable et dont la base de données a une structure prévue pour permettre l'intégration de collections variées. Un important effort a été parallèlement été réalisé dans le domaine de l'" assurance qualité ".

Le CRBIP a été certifié en mars 2005 selon le référentiel ISO 9001 version 2000 pour l'acquisition, la production, la conservation et la distribution de matériels biologiques.

Une démarche est en cours pour l'obtention de l'accréditation des méthodes mises en œuvre lors de l'intégration des microorganismes des collections fermées par le CRBIP, ce qui implique une étape importante de validation de ces méthodes.

Enfin, le logiciel ARPAS étant interrogé à partir de micro-ordinateurs connectés au réseau informatique Internet, le site web a été créé et est fonctionnel depuis le mois de juillet 2005 (http://www.crbip.pasteur.fr).

En donnant au public intéressé (scientifiques, universitaires, enseignants, industriels, etc…), la possibilité d'avoir un accès en ligne aux données relatives aux souches que le centre entretient en collection, un site est un élément significatif de la valorisation du CRBIP.

5. Identification de souches de Acinetobacter au moyen d'une approche phénotypique et moléculaire

Le genre Acinetobacter fut crée en 1954 par Brisou et Prévot. Il est composé de courts bacilles immobiles à Gram négatif. Des analyses phylogénétiques basées sur les séquences d'ARN ribosomal 16S ont permis de classer les Acinetobacter dans la sous-classe gamma des Proteobacteria. Par ailleurs, au sein de ce genre, vingt et un groupes génomiques ont été obtenus par des études d'hybridation ADN-ADN. Cependant, pendant longtemps, le genre Acinetobacter n'a comporté que 7 espèces. Récemment, 9 nouvelles espèces de Acinetobacter ont été décrites. Cela montre que la diversité de ce genre est importante et que beaucoup de souches ne sont pas identifiées.

En vue de définir leur statut taxonomique, vingt-deux souches de Acinetobacter présentes à la Collection de l'Institut Pasteur ont été caractérisées au moyen de différentes méthodes incluant l'analyse phénotypique, l'électrophorèse des protéines totales et le séquençage de l'ARN ribosomal 16S.

Les résultats du séquençage de l'ARNr 16S montrent que 4 souches peuvent être reliées au genomospecies 9, 4 souches à l'espèce Acinetobacter baumanii, 6 souches à l'espèce Acinetobacter parvus, 1 souche au genomospecies 10, 1 souche au genomospecies 13.

Toutefois, une bonne corrélation avec les résultats des autres méthodes utilisées pour l'identification de ces souches n'a pas toujours été obtenue.

6. Approche taxonomique des souches du groupe EF-4

Le groupe CDC EF-4 a été individualisé par E. O. King après l'étude de 85 souches isolées entre 1949-1973. Ces bactéries sont des bacilles à Gram négatif, immobiles, aérobies stricts, catalase et oxydase positive. Le groupe EF-4 a été séparé en deux biovars EF-4a et EF-4b. Le biovar a possède une arginine-dihydrolase contrairement au biovar b.

18 souches du groupe CDC EF-4 isolées chez l'homme suite à des morsures d'animaux pour la plupart et déposées à la Collection de l'Institut Pasteur dans les années 80 sont en cours d'étude en vue de la caractérisation d'un nouveau taxon bactérien. Les méthodes utilisées sont des méthodes phénotypiques, le séquençage de gènes et l'électrophorèse des protéines totales.

Par séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S, 3 groupes sont mis en évidence qui ne sont pas entièrement superposables aux 3 groupes individualisés par l'électrophorèse des proteines totales. De plus, le séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S ne permet pas de distinguer les souches du groupe EF-4 des espèces Neisseria weaveri et Nesseria canis. Le séquençage d'un autre gène est en cours.

7. Caractérisation taxonomique des souches de Microbacterium

Le genre Microbacterium a été décrit en 1919 par Orla Jensen. Il s'agit du genre type de la famille Microbacteriaceae. En 1998, le genre Aureobacterium fut unifié au genre Microbacterium. En 2005, trois nouvelles espèces de Microbacterium furent décrites (M. natoriense, M. oleivorans et M. xylanilyticum) portant à quarante le nombre d'espèces dans ce genre.

Quarante-trois souches de Microbacterium furent déposées à la CIP dans les années 80 et ne sont toujours pas identifiées. La plupart étaient isolées à partir de sang humain alors que les souches du genre Microbacterium se trouvent habituellement dans des échantillons liés à l'environnement. En utilisant l'électroporèse des protéines totales, des méthodes phénotypiques et en séquençant les gènes codants de l'ADNr 16S et le gène gyrB. La taxonomie de ces souches est étudiée afin de les identifier et de pouvoir éventuellement décrire un nouveau taxon.

8. Séquençage du gène codant pour l'ARN 16S des souches types de la Collection

Dans le cadre d'un appel d'offre de la Génopole de l'Institut Pasteur, et afin de contribuer à l'enrichissement de la base de données de la CIP, le gène codant pour l'ARNr 16S des souches types est séquencé systématiquement.

9. Prestations de services

A la CIP sont conservées des collections bactériennes de laboratoires extérieurs à l'Institut Pasteur. Ces collections font l'objet d'un contrat de maintenance.

La CIP prépare des suspensions de spores à la demande de laboratoires industriels.

Ces activités sont incluses depuis 2002 dans le champ de la certification ISO des activités de la Collection.

10. Les relations nationales

Le Ministère de la Recherche a décidé de créer des Centres de Ressources Biologiques (CRB) au niveau national, pilotés par un Comité Consultatif des Ressources Biologiques. Ce Comité dont fait partie la CIP a pour mission de constituer le réseau national des CRB en mettant en place l'Assurance Qualité des Collections et contrôler le lancement d'appels à proposition pour la labellisation et le financement des CRB agréés.

11. Les relations internationales

La CIP fait partie de diverses organisations officielles : l'ECCO (European Culture Collections'Organization -www.eccosite.org), EBRCN (European Biological Resource Centres Network - www.ebrcn.org), CABRI (Common Access to Biotechnological Resources and Information - www.cabri.org) et la WFCC (World Federation for Culture Collection).

1. En 1999, l'OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) a initié à Tokyo un travail international afin d'examiner les conditions nécessaires au soutien des Centres de Ressources Biologiques (CRB).

L'OCDE a confié à la France la Présidence d'un groupe d'étude chargé d'évaluer la faisabilité de la création d'un réseau international de Centres de Ressources Biologiques. La CIP fait partie de la délégation française et pilote la rédaction des documents concernant la mise en place de la démarche qualité et la rédaction des chartes prescriptions obligatoires relatives au fonctionnement des Centres de Ressources Biologiques.

2. La CIP participe au projet européen EBRCN (European Biological Resource Centres Network)

Ce projet européen permet à l'Europe :

. d'exploiter les expertises des CRB dans le domaine de l'information,

. d'établir des politiques communes,

. de maintenir un haut niveau de qualité pour tous les services offerts par les Collections européennes.

Les objectifs du projet sont les suivants :

. établir un réseau de Centres de Ressources Biologiques comprenant des organismes vivants, leurs composants (tels que les acides nucléiques, les sondes, etc.) et les données de bases de données associées, et ainsi de répondre aux récentes initiatives de OCDE dans un contexte international.

. développer des standards européens pour les CRB, basés sur les systèmes de gestion de qualité existants.

. établir un cadre pour maximiser la complémentarité et minimiser la multiplication inutile parmi les CRB européens.

. introduire de nouvelles techniques en Technologie de l'Information afin d'ajouter de la valeur aux informations contenues dans les catalogues et d'en améliorer l'accès.

. recueillir et distribuer des informations pertinentes sur les CRB.

Mots-clés: taxonomie, séquençage, biodiversité, collection, bactéries, expertise, conservation, CRB


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