Unité: Choléra et des Vibrions

Responsable: FOURNIER Jean-Michel

L'activité scientifique de l'Unité du Choléra et des Vibrions est focalisée sur le choléra et sur les infections à vibrions non cholériques. Notre contribution à la lutte contre le choléra, qui constitue encore un problème majeur de santé publique à l'échelle mondiale, comporte : (1) la surveillance et l'épidémiologie moléculaire du choléra; (2) le développement d'un test de diagnostic rapide du choléra ; (3) la mise au point d'un nouveau vaccin conjugué chimiquement défini. Nous nous intéressons aussi aux vibrions non cholériques isolés chez l'homme et dans les produits de la mer. Notre laboratoire est désigné par le Ministère de la Santé "Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra" en raison de son expertise dans ces domaine et l'Unité est en cours de désignation comme Centre Collaborateur de l'OMS pour le choléra et les autres infections à vibrions.

1. Surveillance et épidémiologie moléculaire du choléra (Marie-Laure QUILICI)

Le choléra reste aujourd'hui une maladie grave, autant pour les individus que pour les collectivités. Selon l'OMS, le nombre de personnes exposées à cette maladie a augmenté de façon spectaculaire à la suite de la dégradation des conditions socio-économiques survenue ces dernières années dans de nombreuses régions du monde, créant les conditions d'un problème majeur à l'échelle mondiale.

Les cas de choléra dus à Vibrio cholerae O1 ou à V. cholerae O139 sont signalés dans tous les continents. Comme la plupart des pays développés, la France n'est pas directement concernée par des épidémies de choléra. Cependant des cas de choléra importés sont régulièrement diagnostiqués chez des voyageurs (2 cas importés en France en 2005). C'est pourquoi nous collaborons avec des biologistes de pays atteints par ces épidémies, avec les instituts du Réseau International des Instituts Pasteur et Instituts Associés, ainsi qu'avec des organisations humanitaires.

Toutes les souches de vibrions cholériques reçues au CNR, en provenance de l'étranger, sont étudiées par deux méthodes de typage moléculaire : l'étude des profils de restriction des gènes codant pour les ARN ribosomiques (ribotypes) et l'étude des profils de migration électrophorétique de l'ADN total après macrorestriction enzymatique (pulsotypes). L'analyse de plus de 500 souches isolées sur une période de 35 années depuis l'arrivée du choléra en Afrique en 1970 a révélé un degré important d'homologie entre les souches de V. cholerae d'origines géographiques différentes et isolées à plusieurs dizaines d'années d'intervalle. Ce résultat est en faveur du caractère clonal des souches responsables de la 7ème pandémie cholérique sur ce continent. Nous avons également étudié plus de 150 souches de V. cholerae O1 isolées au Mexique entre 1991 et 2000. La base de données qui a pu être établie à la suite de ces différentes études représente un outil très utile pour étudier de nouvelles souches de V. cholerae qui pourraient être importées en France.

2. Test de diagnostic rapide du choléra (Alain BOUTONNIER, Jean-Michel FOURNIER)

Dans le cadre de notre programme de recherche sur la vaccination contre le choléra, les anticorps monoclonaux spécifiques des lipopolysaccharides de V. cholerae O1 et de V. cholerae O139 que nous avions préparés dans l'unité ont été utilisés pour développer, en collaboration avec le Laboratoire d'Ingénierie des Anticorps de l'Institut Pasteur à Paris et avec l'Institut Pasteur de Madagascar, un test de diagnostic rapide du choléra, permettant de détecter les souches des deux sérogroupes de l'espèce V. cholerae responsables du choléra : V. cholerae O1 et V. cholerae O139. Ce test, fondé sur le principe de l'immunochromatographie, a été évalué à Madagascar, au Bangladesh et au Mozambique. Sa sensibilité et sa spécificité ont été comparées, dans un centre de traitement des maladies diarrhéiques au Bangladesh, à celles de deux autres tests commercialisés. Notre test s'est révélé le plus sensible, quel que soit le degré de technicité de l'utilisateur. C'est donc le test le mieux adapté à une utilisation dans des endroits isolés ou dans des camps de réfugiés. Ce test est maintenant commercialisé par une société indienne.

3. Programme de recherche sur un nouveau vaccin conjugué chimiquement défini (Alain BOUTONNIER, Cyrille GRANDJEAN, Bruno DASSY, Jean-Michel FOURNIER)

Le choléra est une maladie diarrhéique épidémique provoquée par des bactéries appartenant à 2 sérogroupes de l'espèce Vibrio cholerae. Nous sommes actuellement dans la 7ème pandémie qui a débuté en Inde en 1961, envahi l'Afrique à partir de 1970 et atteint l'Amérique Latine en 1991. Cette 7ème pandémie est due à V. cholerae sérogroupe O1, biotype El Tor, sérotypes Ogawa ou Inaba. Un nouveau sérogroupe de V. cholerae, O139, apparu en Inde en 1992, est actuellement en expansion en Inde et au Bangladesh et représente une menace mondiale, dans la mesure où il n'existe pas de protection croisée entre les deux sérogroupes. C'est pourquoi il est urgent de pouvoir disposer d'un vaccin anticholérique protégeant aussi bien contre V. cholerae O1 que contre V. cholerae O139, efficace à long terme chez tous les groupes d'âge, en particulier chez les enfants de moins de 5 ans qui sont particulièrement touchés par le choléra.

Le point de départ de notre recherche a été de déterminer quels anticorps protègent l'homme contre le choléra. Nous avons démontré que des immunoglobulines G (IgG) monoclonales, dirigées contre la partie polysaccharidique du lipopolysaccharide de V. cholerae O1, porteuse de la spécificité des sérogroupes et sérotypes, étaient protectrices dans un modèle d'infection expérimentale du souriceau nouveau-né. Nous avons alors commencé la préparation de vaccins anticholériques conjugués, constitués de polysaccharides de V. cholerae O1 ou de V. cholerae O139 couplés par une liaison covalente à une protéine porteuse de façon à induire une réponse thymodépendante de longue durée. Nous avons obtenu un vaccin, constitué de la partie polysaccharidique du lipopolysaccharide de V. cholerae O139 conjugué à l'anatoxine tétanique, qui induit chez la souris une réponse protectrice thymodépendante. Cette année, nous avons rencontré des difficultés pour produire un lot clinique de conjugué avec le polysaccharide de V. cholerae O139. Ces difficultés sont liées à une mauvaise reproductibilité de la méthode de détoxification du lipopolysaccharide.

Nous avons poursuivi nos efforts visant à préparer de nouveaux conjugués dans lesquels l'immunogénicité du déterminant antigénique commun aux sérotypes Ogawa et Inaba de V. cholerae O1 serait préservée. En collaboration avec Laurence A. Mulard, Unité de Chimie Organique, nous avons développé une méthode innovante de conjugaison fondée sur un couplage spécifique de site entre le polysaccharide et la protèine porteuse. Dans le cadre de cette investigation, nous avons conçu un lien fonctionnalisé par des groupements phosphines, adapté à la dérivatisation de protéines porteuses. Ces protéines porteuses ont ensuite été conjuguées par un lien amide au polysaccharide fonctionnalisé par un groupement azide, en utilisant la ligation de Staudinger sans trace. Bien que les conjugués obtenus soient antigéniques, aucun d'entre eux n'a induit de réponse protectrice thymodépendante chez la souris.

Nous avons aussi poursuivi l'investigation, par des méthodes immunochimiques et physicochimiques, de la structure du déterminant antigénique commun aux sérotypes Ogawa et Inaba de V. cholerae O1. Ce travail a été réalisé en collaboration avec l'Unité de Biochimie structurale et la Plate-forme de cristallogénèse et diffraction des rayons X. Des fragments Fab d'un anticorps monoclonal reconnaissant ce déterminant antigénique ont été obtenus après digestion de l'anticorps par la papaïne et séparation des fragments d'anticorps par chromatographie d'échange d'ions et par filtration sur gel. Des cristaux ont été obtenus par la méthode de diffusion vapeur en goutte suspendue. La structure du cristal de fragment Fab a été déterminée à la résolution de 2,8 Å en utilisant la méthode de remplacement moléculaire. La structure du cristal montre qu'il existe une cavité pouvant recevoir un monosaccharide terminal du lipopolysaccharide dans le site de combinaison de l'anticorps à l'antigène. Des calculs de mécanique moléculaire et des essais de co-cristallisation de complexes composés de fragment Fab de l'anticorps et de polysaccharide purifié sont en cours en vue d'élucider la structure du déterminant antigénique commun aux sérotypes Ogawa et Inaba de V. cholerae O1. La connaissance de cette structure pourrait avoir un impact important pour une approche rationnelle de la conception d'un conjugué protégeant contre V. cholerae O1.

4. Études moléculaires des vibrions non cholériques (Annick ROBERT-PILLOT, Marie-Laure QUILICI)

Les vibrions sont des bactéries à Gram négatif qui colonisent l'environnement marin. On distingue les "vibrions cholériques", incluant les isolats appartenant aux sérogroupes O1 et O139 de l'espèce V. cholerae, et les "vibrions non cholériques", incluant les isolats de V. cholerae appartenant aux sérogroupes autres que les sérogroupes O1 et O139 - appelés V. cholerae non-O1/non-O139 - et les isolats appartenant aux autres espèces du genre Vibrio. Deux espèces sont plus fréquemment isolées en pathologie humaine : V. parahaemolyticus et V. vulnificus, et quatre autres espèces sont plus rarement isolées : V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hollisae et V. mimicus.

Les modifications écologiques de l'environnement marin fournissent aux vibrions des conditions idéales pour leur prolifération. Le développement du commerce international et de la consommation des produits de la mer à l'état cru et l'accroissement du nombre de personnes immunodéprimées font craindre une augmentation du nombre d'infections dues aux vibrions non cholériques dans les pays européens. Aussi, une surveillance microbiologique de ces germes devrait-elle contribuer à en limiter les risques pour la santé publique.

Les méthodes classiques d'identification bactérienne ne sont pas adaptées à l'étude de souches de vibrions isolées de l'environnement, et l'importance des vibrions en santé publique justifie le développement de méthodes moléculaires pour détecter, identifier et caractériser les facteurs de pathogénicité des souches humaines ou environnementales (eau de mer, produits de la mer). Nous avons développé cette année une méthode PCR en temps réel pour détecter et quantifier directement deux espèces d'intérêt médical - V. cholerae et V. parahaemolyticus - dans des échantillons artificiellement contaminés. Des amorces nucléotidiques spécifiques des espèces V. cholerae (espace intergénique des ARN 16S-23S) et V. parahaemolyticus (séquence R72H) ont été utilisées dans un système de détection utilisant la méthode du SYBR green. Les différents paramètres de la réaction, en particulier la concentration optimale de MgCl2, ont été optimisés. Concernant le protocole d'extraction de l'ADN bactérien, les meilleurs résultats sur les échantillons artificiellement contaminés ont été obtenus après traitement par une matrice Instagene (Bio-Rad). La quantification bactérienne a été réalisée par extrapolation à partir de courbes standards établies sur des ADN purifiés. La sensibilité est de 50 unités formant colonies (UFC), aussi bien avec V. cholerae inoculé dans l'eau qu'avec V. parahaemolyticus inoculé dans le liquide du manteau d'une huître. La PCR quantitative a aussi été optimisée pour détecter la présence des gènes de la toxine cholérique chez V. cholerae et des gènes de l'hémolysine thermostable directes (tdh) et de l'hémolysine reliée à la TDH (trh) chez V. parahaemolyticus, gènes qui sont des marqueurs du pouvoir pathogène de ces espèces. Alors que cette PCR s'est révélée spécifique pour la toxine cholérique, elle ne l'a pas été pour le gène tdh de V. parahaemolyticus, du fait de réactions croisées avec les gènes tdh des souches de V. cholerae et de V. hollisae. Nous dessinons actuellement de nouvelles amorces qui seraient spécifiques de l'hémolysine TDH de V.parahaemolyticus, permettant ainsi de détecter directement dans un échantillon biologique les isolats pathogènes de cette espèce. Même s'il reste nécessaire d'améliorer la limite de détection de cette PCR quantitative, la méthode s'est néanmoins révélée très sensible et beaucoup plus rapide que la méthode classique de dénombrement bactérien (méthode dite du nombre le plus probable, NPP) pour évaluer l'importance d'une population de V. cholerae ou de V. parahaemolyticus dans un milieu artificiellement contaminé.

5. Activités du Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra (Marie-Laure QUILICI, Jean-Michel FOURNIER)

Le CNRVC est responsable de l'identification des souches de vibrions cholériques à l'origine de cas de choléra survenant en France, où, comme dans de nombreux pays, cette maladie est à déclaration obligatoire. Un faible nombre de cas de choléra (inférieur à 5) surviennent chaque année en France et sont, pour la plupart, importés. Deux cas, importés du Pakistan, ont été identifiés en 2005. La collaboration avec des biologistes de pays concernés par des épidémies de choléra et avec des organisations non gouvernementales nous permet d'étudier de nouvelles souches de vibrions cholériques susceptibles d'être importées en France. Dans le cadre de ces collaborations, nous avons cette année isolé ou confirmé l'identification de 62 souches de vibrion cholérique provenant d'Afrique.

Le CNRVC est aussi responsable de l'identification de souches de vibrions non cholériques d'origine humaine. Ces vibrions non cholériques sont à l'origine de gastro-entérites, d'infections de la peau et des tissus mous, de septicémies, et de diverses infections extra-intestinales comme des otites. Les patients ayant une pathologie sous-jacente immunosuppressive sont exposés à une dissémination rapide de l'infection causée par ces germes. Dans la majorité des cas, ces infections sont associées à un contact direct avec l'eau de mer ou à la consommation de produits de la mer, et surviennent pendant les mois les plus chauds de l'année.

En 2005, 10 cas humains d'infections à vibrions non cholériques ont été identifiés par le CNRVC. Cinq cas de septicémies et/ou de gastro-entérites et deux cas de suppurations ont été causés par V. cholerae non-O1/non-O139. Aucune des souches de V. cholerae non-O1/non-O139 ne possédait les gènes de la toxine cholérique. Trois cas de suppurations diverses ont été provoqués par V. alginolyticus.

Depuis 1995, le CNRVC a mis en place un système de surveillance des infections françaises à vibrions non cholériques. Les données cliniques et épidémiologiques, concernant notamment l'existence d'un terrain prédisposant et la notion ou non de contact avec la mer ou l'ingestion de produits de la mer, sont systématiquement recueillies pour chaque souche d'origine humaine reçue au CNRVC. Nous avons fait en 2005 une synthèse des données recueillies les dix dernières années, de 1994 à 2004. Au total, 93 cas d'infections à vibrions non cholériques ont été étudiés.

Ces infections peuvent être classées en plusieurs syndromes cliniques : gastro-entérite accompagnée ou non de septicémie, blessure infectée accompagnée de septicémie, septicémie primaire sans notion de gastro-entérite ou de blessure infectée, et enfin suppurations diverses. V. cholerae non-O1/non-O139 a été le plus souvent isolé (47,% des patients) et a été associé à tous les syndromes. Aucune de ces souches ne possédait les gènes de la toxine cholérique. L'espèce V. parahaemolyticus, qui était le plus souvent associée à des gastro-entérites, et l'espèce V. alginolyticus, qui était le plus souvent associée à des suppurations diverses, ont été chacune isolées de 18,3 % des patients. Parmi les 17 souches de V. parahaemolyticus, 15 souches possédaient au moins l'un des 2 gènes d'hémolysine (11 souches avec le gène tdh, 3 avec le gène trh et 1 avec les 2 gènes). Cinq souches de V. parahaemolyticus appartenaient au nouveau clone pandémique O3 :K6. Les données épidémiologiques ont montré que 3 patients sur les 5 contaminés par les souches de ce clone avaient consommé des produits de la pêche locaux, collectés à plusieurs années d'intervalle, dans des zones non contrôlées des côtes françaises. Cela démontre que ce clone pandémique de V. parahaemolyticus a été introduit et suggère qu'il possède la capacité de persister sur les côtes françaises. L'espèce V. vulnificus a été isolée de 11,8 % des patients, essentiellement de blessures infectées accompagnées de septicémie. Toutes les souches de V. vulnificus possédaient le gène de l'hémolysine hly.

Parmi les 93 patients, 65 (70%) ont été hospitalisés et 8 (7%) sont décédés. Sept des 8 patients décédés présentaient un terrain prédisposant. De même, les septicémies sont survenues dans la majorité des cas chez des patients présentant un terrain prédisposant. Parmi les patients pour lesquels l'information était disponible, 80,5% ont été contaminés en France. Ces infections étaient en majorité associées à la consommation de produits de la mer dans les 7 jours précédents, ou à un contact direct avec l'eau de mer ou avec des produits de la mer. Les infections à vibrions non cholériques étaient plus fréquentes pendant les mois chauds de l'année, de mai à octobre. La surveillance de ces infections est rendue difficile par le fait qu'elles ne sont pas à déclaration obligatoire et, qu'en conséquence, ce sont essentiellement les formes graves qui sont signalées au CNRVC. De fait, une étude réalisée par l'Institut de Veille Sanitaire a montré que le nombre de cas d'infections à vibrions non cholériques identifiés par le CNRVC n'était représentatif que des formes graves. Cependant, malgré le nombre relativement faible d'infections signalées en France, il est indispensable de maintenir un système de surveillance de ces pathogènes en raison de l'augmentation prévisible du nombre de personnes susceptibles à ces infections, notamment des personnes immunodéprimées, de la sévérité des pathologies provoquées, notamment par V. vulnificus, et de l'introduction et de la probable implantation sur les côtes françaises du clone pandémique de V. parahaemolyticus.

Le CNRVC identifie également des souches de vibrions non cholériques isolées de produits de la mer importés en France. En 2005, parmi les 172 souches étudiées, les espèces V. cholerae, V. parahaemolyticus et V. alginolyticus ont été le plus souvent rencontrées. Tous les isolats de V. vulnificus d'origine alimentaire possédaient le gène hly, indiquant que toutes ces souches sont potentiellement pathogènes. En revanche, un très faible pourcentage (<1%) de souches de V. parahaemolyticus isolées de produits de la mer importés possédait un gène d'hémolysine. Aucune des souches de V. cholerae non-O1/non-O139 isolées de produits de la mer ne possédait les gènes de la toxine cholérique.

Par ailleurs, 173 souches de vibrions non cholériques isolées de produits de la mer ou de l'environnement ont été étudiées dans le cadre de collaborations avec des laboratoires marocain (Institut national de recherche halieutique) et malgache (Institut Pasteur de Madagascar).

Le CNRVC a participé a des enseignements post-universitaires. Il a aussi été impliqué dans la formation de microbiologistes et de cliniciens. Des formations sur les méthodes classiques et moléculaires d'étude des vibrions cholériques et non cholériques ont été dispensées au Maroc et au Cameroun à des microbiologistes, techniciens et étudiants de plusieurs pays (Algérie, Bangladesh, Cameroun, Côte d'Ivoire, France, Madagascar, Mali, Maroc, Mauritanie, Mexique, République Centrafricaine, République Démocratique du Congo, Sénégal, Tunisie).

Légende de la photo :

Test de diagnostic rapide du choléra : le coffret comprend tout le matériel nécessaire pour la réalisation du diagnostic du choléra auprès du malade : bandelettes sous emballage individuel en aluminium ; tubes à essai, pipette en plastique pour prélever et déposer l'échantillon de selles dans le tube à essai ; portoir pour tubes.

Mots-clés: choléra, vibrions, vaccination, conjugué, diagnostic, épidémiologie moléculaire, produits de la mer, santé publique


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