Unité: Chimie Organique

Responsable: Bost Pierre-Etienne

Avec la perspective de mettre en évidence de nouvelles approches thérapeutiques, la conception, la synthèse et l'étude de molécules biologiquement actives représentent les principales activités de l'Unité de Chimie Organique. L'accès à des molécules originales (vaccins, inhibiteurs d'enzymes ou produits spécifiques de certaines cibles biologiques), la caractérisation de leurs structures et de leurs interactions constituent des outils essentiels d'étude des mécanismes cellulaires normaux ou pathologiques. Les études biochimiques des nucléoside monophosphate kinases et des phosphatases, les programmes de sélection in vitro et in vivo, l'évolution dirigée d'enzymes complètent ce dispositif.

Synthèse peptidique

(Françoise Baleux, Yves-Marie Coïc)

Spécialisée dans la synthèse de peptides, notre équipe est impliquée dans de nombreuses collaborations avec des équipes pasteuriennes et extérieures.

Une grande partie de l'activité est dédiée à l'optimisation de séquences peptidiques capables d'interférer avec l'état d'oligomérisation de la protéine NEMO (IKKγ) dans le cadre d'une collaboration avec F. Agou et M. Véron (unité de régulation enzymatique des activités cellulaires). A ce jour, une cinquantaine de peptides ont été synthétisés. Les résultats biologiques montrent que des peptides issus du domaine d'oligomérisation de NEMO sont capables de bloquer l'activation de la voie NF-κB en réponse à plusieurs stimuli pro-inflammatoires (LPS, IL-1, TNF-α) ou carcinogène (PMA) avec des IC50 de l'ordre du μmolaire et d'induire l'apoptose de cellules cancéreuses dans la même gamme de concentration. Ces résultats valident le concept d'une nouvelle stratégie d'inhibition de la voie NF-κB dans les thérapies anti-inflammatoires et anti-cancéreuses.

Parallèlement à la synthèse de longs peptides (chimiokines, domaine d'oligomérisation de NEMO), des fragments de ß-caténine (peptides phosphorylés), une mini-protéine membranaire (PMP1) et des peptides antimicrobiens (Dermaseptines S4) ont également été synthétisés pour des études de structures et de relations structure-activité.

De l'antigène polysaccharidique au vaccin glycoconjugué anti-infectieux

(Laurence Mulard, Catherine Guerreiro, Ioannis Vrasidas, Cyrille Grandjean, Julien Boutet)

Les polysaccharides capsulaires (PC) et lipopolysaccharides (LPS) sont des antigènes privilégiés dans la conception de vaccins anti-bactériens. Si des vaccins polysaccharidiques efficaces contre certaines infections respiratoires dues à des bactéries capsulées sont aujourd'hui commercialisés avec succès, il n'existe encore aucun vaccin polysaccharidique contre les infections entériques causées par des bactéries Gram négatif exprimant un LPS mais dépourvues de PC. L'activité de l'équipe Glycochimie vise à pallier ce manque pour Vibrio cholerae O1 et Shigella flexneri, principaux responsables du choléra et de la dysenterie bacillaire, respectivement. L'objectif est d'utiliser la partie polysaccharidique des LPS (ppLPS) homologues pour développer des vaccins de type glycoconjugués chimiquement définis. Un autre axe de recherche développé dans l'équipe porte sur les infections fongiques associées à Cryptococcus neoformans.

Vibrio cholerae O1 : Ciblant un vaccin bivalent, efficace contre les deux sérotypes Ogawa et Inaba de V. cholerae O1, nous avons synthétisé plusieurs conjugués par couplage via un point d'ancrage unique du ppLPS de V. cholerae O1 sérotype Inaba sur une protéine porteuse. Evaluée chez la souris, l'immunogénicité de ces néoglycoprotéines suggère que les propriétés immunologiques de cet antigène polysaccharidique sont extrêmement complexes (coll. J.-M. Fournier, Unité du Choléra et des Vibrions). Une méthode de ligation chimique originale a été développée.

Cryptotoccus neoformans : L'objectif est de confirmer la structure hypothétique de la capsule de ce champignon opportuniste et d'en comprendre les propriétés immunologiques (coll. G. Janbon, Unité de Mycologie Moléculaire). Le développement de stratégies de synthèse innovantes et performantes d'oligosaccharides représentatifs de la capsule de C. neoformans est en cours.

Shigella flexneri 2a : Notre objectif principal est de développer des immunogènes présentant de façon optimale une combinaison d'épitopes B osidiques et d'épitopes T permettant l'induction d'une réponse mémoire. Suite à l'identification d'un épitope protecteur immunodominant porté par l'antigène O de S. flexneri 2a, des haptènes saccharidiques représentatifs de cet épitope et différant en taille ont été obtenus selon des stratégies de synthèse multi-étapes originales. Plusieurs néoglycoconjugués chimiquement définis, issus du couplage via un point d'ancrage unique de ces haptènes synthétiques à une protéine porteuse compatible avec une utilisation chez l'homme, ont été conçus. Certains des glycoconjugués semi-synthétiques obtenus, dits de troisième génération, induisent chez la souris des titres en anticorps anti-LPS supérieurs à ceux d'un conjugué ppLPS-protéine conventionnel. Un pentadécasaccharide a été identifié comme mime fonctionnel puissant et hautement spécifique de l'antigène O de S. flexneri 2a (coll. A. Phalipon, Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire). L'analyse des bases structurales à l'origine de ce mimétisme est en cours (coll. M. Delepierre, Laboratoire de RMN des Biomolécules, B. Vulliez-Le Normand, Unité d'Immunologie Structurale). Une étude clinique phase I est envisagée.

Glycoconjugués porteurs de phosphorylcholine pour le développement de thérapies contre les infections respiratoires

(Christelle Ganneau, Sylvie Bay)

L'objectif est de développer une nouvelle approche, basée sur l'utilisation d'anticorps thérapeutiques, pour combattre certaines infections bactériennes du tractus respiratoire (Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis). Dans ce but, nous avons synthétisé un mime d'un antigène naturel ubiquitaire exprimé à la surface des bactéries, la phosphorylcholine (ChoP) glycosylée, synthon à partir duquel nous avons préparé plusieurs composés vaccinaux synthétiques et hémi-synthétiques. L'un d'entre eux, un conjugué protéique, induit des anticorps spécifiques qui reconnaissent ChoP sur deux bactéries différentes S. pneumoniae et N. meningitidis. Des anticorps monoclonaux contre certains de ces vaccins sont en cours de production (collaboration avec P. Lafaye, Unité de Génétique et Biochimie du Développement, J-M. Alonso, Unité des Neisseria, F. Nato, PF5).

Glycoconjugués à potentiel vaccinal anti-tumoral

(Teresa Freire, Christelle Ganneau, Sylvie Bay)

En collaboration avec C. Leclerc et R. Lo-Man (Unité de Recherche de Régulation Immunitaire et Vaccinologie), notre programme de recherche vise à développer des vaccins anti-cancer basés sur le marqueur tumoral osidique Tn. Nous avons ainsi mis au point un vaccin synthétique, le MAG ou Multiple Antigenic Glycopeptide, pour lequel un développement clinique est actuellement envisagé par l'Institut Pasteur.

Afin de faciliter les synthèses, nous étudions une nouvelle méthode de préparation enzymatique pour ce type de produits complexes. Les vaccins glycoprotéiques obtenus sont constitués d'une mucine associée à certains cancers (MUC6) et présentant une forte densité en antigènes Tn. Leurs propriétés immunologiques sont en cours d'évaluation.

Chimie médicinale

(Yves Janin)

Une nouvelle famille d'antituberculeux présentant un mode d'action original est en cours d'étude. Un autre exemple de recherche d'antituberculeux originaux prend l'isoniazide comme point de départ. Son mécanisme d'action est toujours sujet de recherche. Il a été démontré récemment que ce médicament agit grâce à une activation métabolique par une catalase mycobactérienne conduisant à la formation d'un adduit isoniazide-NADH. cet adduit (ou une structure voisine) inhibe une enoyl reductase de la mycobactérie et conduit à l'arrêt de la croissance bactérienne. Nous travaillons actuellement à la synthèse et à l'évaluation de composés qui miment cet adduit et conserveraient une activité d'inhibition de l'énoyle réductase de Mycobacterium tuberculosis.

Nucléoside monophosphate kinases - synthèse d'inhibiteurs et activité antimycobactérienne d'analogues de nucléosides

(Hélène Munier-Lehmann, Khaled Benkali, Cécile Gasse, Laurence Dugué, Valérie Huteau, Sylvie Pochet)

Les NMPKs assurent la phosphorylation des différents nucléosides monophosphate en dérivés diphosphate et sont caractérisées par une grande spécificité pour le nucléoside monophosphate accepteur. Les cinq NMPKs de M. tuberculosis ont été exprimées, purifiées et caractérisées. Elles présentent des caractéristiques distinctes de leurs homologues eucaryotes. Codées par des gènes essentiels, elles constituent donc des cibles nouvelles d'intérêt pour la recherche d'antituberculeux. La première structure cristallographique disponible a été celle de la TMPK. Différentes approches ont été suivies pour concevoir des inhibiteurs spécifiques de cette enzyme : synthèse d'analogues du substrat naturel, criblage in silico de banques de molécules, conception de molécules non nucléosidiques. Une première famille originale d'inhibiteurs spécifiques et actifs in vitro sur cultures bactériennes (BCG, H37Rv) a ainsi été mise en évidence très récemment. Une stratégie comparable sera appliquée aux autres NPMKs.

Analogues de nucléosides à potentiel antiviral dans la stratégie d'hypermutagénèse

(Laurence Dugué, C. Cadena, Sylvie Pochet)

La plupart des antiviraux utilisés actuellement sont des analogues de nucléosides qui présentent le plus souvent des modifications du sucre lié à la base et qui agissent sur la réplication virale proprement dite. L'utilisation de nucléosides pro-mutagènes pour augmenter le taux de mutations des virus au delà de leur viabilité (stratégie d'hypermutation) a récemment été illustrée pour des retrovirus et des virus à ARN. L'un des avantages de cette stratégie serait le faible taux de resistance des virus à ces analogues. Par une approche de synthèse parallèle, nous avons synthétisé en série ribose et 2'-désoxyribose, une série d'analogues nucléosidiques ayant pour nucléobase des hétérocycles capables de s'apparier à plusieurs des bases canoniques. L'évaluation de ces analogues sur l'extinction de différents virus à ARN est en cours (collaboration E. Domingo, Madrid, et M.-A. Martinez, Badalona).

Etude de la spécificité de substrat de la TMPK de vaccine

(Laurence Dugué, Cécile Gasse, Sylvie Pochet)

En collaboration avec D. Deville-Bonne (Institut J. Monod, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6), différents analogues fluorescents du thymidylate ont été synthétisés dans le but de caractériser le site dTMP de la TMPK de vaccine. Une étude de spécificité a été menée à l'aide d'une première série d'analogues nucléotidiques. Nous aborderons ensuite la synthèse d'inhibiteurs et de substrats alternatifs de la vvTMPK en tant qu'antiviraux potentiels.

Evolution dirigée d'enzymes

(Jean-Luc Jestin, Pierre-Alexandre Kaminski, Sophie Vichier-Guerre)

Alors que les stratégies classiques d'évolution dirigée d'enzymes font appel au criblage, nous développons des méthodes de sélection qui permettent d'analyser simultanément l'activité catalytique de plus de 10e8 protéines distinctes. Les sélections en fonction de l'activité catalytique sont réalisées in vivo en utilisant des souches appropriées de bactéries Escherichia coli et in vitro en utilisant une chimie des Inovirus ou bactériophages filamenteux.

Des ADN-polymérases ADN-dépendantes thermostables dotées d'activités catalytiques de type transcriptase inverse thermostable ont été sélectionnées in vitro. D'autre part, cette stratégie d'ingénierie d'enzymes est appliquée à l'isolement de glycosyltransférases pour faciliter la synthèse de glycoconjugués à potentiel vaccinal. Enfin, des variants de N-désoxyribosyltransférases acceptant des analogues de nucléosides ont été isolés par sélection in vivo.

Au delà des applications de ces nouvelles enzymes, ce sont les relations entre les séquences, les structures et les activités catalytiques de ces enzymes qui présentent un intérêt particulier.

Protéine Phosphatases PP1/PP2A et apoptose : cibles thérapeutiques potentielles

(Alphonse Garcia, Julien Guergnon,Virginie Maire, Angélique Godet)

Le groupe phosphatase à récemment proposé une nouvelle approche thérapeutique (concept DPT) basée sur l'inhibition de processus pathologiques par transfert intracellulaire de peptides mimant des sites d'interaction avec des protéines de la famille des protéine phosphatase 1 (PP1) et 2A (PP2A) (Guergnon et al. Mol.Pharmacol sous presse ). Sur la base de ce concept notre projet actuel consiste essentiellement à caractériser deux peptides apoptotiques issus de deux protéines virales, HIV1 VPR et E4orf4 d'Adénovirus canin, qui interagissent avec PP2A pour provoquer l'apoptose de cellules humaines.

Mots-clés: glycopeptide, glycoprotéine, cancer, immunothérapie, vaccins, carbohydrate, infections entériques, peptides, chimiokines, nucléosides hétérodoxes, agents antituberculeux, sélection in vivo d'enzymes, évolution in vitro, phage display, nucléoside monophosphate kinases, PP1/PP2A, apoptose


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