Unité: Biochimie des Interactions macromoléculaires

Responsable: Daniel LADANT

Nos recherches sont centrées sur l'étude des mécanismes moléculaires qui gouvernent les interactions protéine-protéine et les interactions protéine-membrane. Ces questions sont abordées, pour l'essentiel, en utilisant comme système modèle une toxine bactérienne, l'adénylcyclase (CyaA) produite par Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche. Les connaissances fondamentales concernant les mécanismes d'entrée de la toxine AC dans les cellules cibles et son interaction avec divers effecteurs cellulaires sont exploitées pour différentes applications en vaccinologie et biotechnologie.

1- Etudes des relations structure/fonction de la toxine CyaA

CyaA est l'un des facteurs de virulence essentiels de B. pertussis et présente plusieurs propriétés particulièrement intéressantes d'un point de vue fondamental : CyaA est sécrétée par les bactéries et possède la capacité de pénétrer dans les cellules eucaryotes cibles où, activée par la calmoduline (CaM), elle synthétise activement de l'AMP cyclique ce qui altère le métabolisme cellulaire. CyaA est une protéine bifonctionnelle de 1706 acides aminés: l'activité catalytique calmoduline-dépendante est localisée dans les 400 premiers acides aminés. La partie C-terminale de 1300 résidus environ est impliquée dans la reconnaissance et l'intoxication des cellules cibles. L'une des propriétés particulièrement intéressantes de cette toxine réside en effet dans son mode très original d'invasion des cellules cibles. En effet la toxine AC possède la propriété de pouvoir délivrer son domaine catalytique N-terminal dans le cytoplasme des cellules cibles directement à travers la membrane plasmique de ces cellules. Nos travaux récents ont porté sur la caractérisation de l'interaction de CyaA avec le calcium qui est un effecteur clé pour la translocation du domaine catalytique dans les cellules cibles. CyaA est capable de fixer une quarantaine d'ions calcium sur des séquences répétées dites RTX (Repeat in ToXin), localisées dans la partie C-terminale de la protéine, caractéristiques d'une famille de cytolysines produites par différentes bactéries pathogènes. Le domaine RTX de CyaA est également impliqué dans l'interaction avec le récepteur cellulaire de la toxine, l'intégrine αMβ2. Nous avons caractérisé différents fragments du domaine RTX, en combinant des approches biochimiques (complémentation fonctionnelle) et biophysiques (électrophysiologie, dichroïsme circulaire, fluorescence et sédimentation). Nous avons pu préciser les conditions de fixation des ions calcium sur les séquences répétées de ces différents modules, ainsi que les changements structuraux et fonctionnels induits par l'association de ce co-facteur. Ces résultats nous ont conduits à proposer un modèle pour le repliement du domaine RTX et pour ses implications fonctionnelles.

2 - Protéines CyaA recombinantes comme vecteurs d'antigènes (en collaboration avec l'équipe de C. Leclerc, Régulation Immunitaire et Vaccinologie, Institut Pasteur)

Nos travaux antérieurs ont permis de montrer que la protéine CyaA constitue un système vecteur non-réplicatif remarquablement efficace pour délivrer des antigènes d'intérêt dans les cellules présentatrices d'antigènes, afin d'induire des réponses immunitaires à médiation cellulaire. Des antigènes peuvent être greffés dans le domaine catalytique de toxines CyaA recombinantes génétiquement détoxifiées qui sont ciblées très efficacement in vivo vers les cellules dendritiques (DC) qui expriment le récepteur spécifique, l'intégrine αMβ2. Dans ces cellules présentatrices d'antigènes professionnelles, les antigènes sont dégradés et apprêtés pour être présentés aux molécules des complexes majeurs d'histocompatibilité de classe I (CMH-I) et de classe II (CMH-II) afin d'activer des lymphocytes T cytotoxiques (CD8+ ) et des lymphocytes T auxiliaires (CD4+ ) spécifiques (Figure 1). Nos résultats récents ont démontré dans deux modèles précliniques les potentialités en immunothérapie anti-tumorale de toxine CyaA recombinantes portant des antigènes de tumeur. Dans le cadre d'une collaboration avec la société BT PHARMA (Labège, France, www.btpharma.com ) notamment, nous avons montré que des protéines CyaA recombinantes portant une protéine oncogénique (E7) du virus du papillome humain sont capables de stimuler chez la souris des réponses immunitaires thérapeutiques extrêmement efficaces, capables d'éradiquer totalement des tumeurs murines exprimant la protéine E7, tumeurs qui sont létales pour les souris non-immunisées. D'autre part, des CyaA recombinantes portant la protéine TAT du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) sont capables d'induire, chez la souris, outre des réponses immunitaires cellulaires (T auxiliaires et cytotoxiques) spécifiques, des anticorps anti-TAT neutralisants (vis-à-vis des propriétés transactivatrices de TAT). L'immunogénéicité de ces molécules est en cours d'évaluation dans des modèles primates.

3 - Caractérisation d'interactions entre protéines membranaires impliquées dans la division cellulaire chez Escherichia coli.

Nous avons élaboré antérieurement un système génétique qui permet de détecter in vivo, dans la bactérie E. coli, par des tests phénotypiques simples, des interactions protéine-protéine. Ce système " double hybride " (BACTH) est fondé sur la complémentation fonctionnelle de deux fragments complémentaires du domaine catalytique de l'adénylcyclase de B. pertussis, fusionnés aux deux protéines d'intérêt (figure 2). Ce test génétique, fondé sur une cascade de signalisation adénylcyclase/AMPc, s'avère particulièrement approprié pour analyser l'assemblage de complexes de protéines membranaires. Au cours de l'année 2005, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'étude d'assemblage de complexes de protéines membranaires impliquées dans le processus de division cellulaire chez E. coli. La formation du septum de division cellulaire (septososme) chez E . coli est catalysée par un ensemble de protéines essentielles (dites Fts) qui s'assemblent dans une structure annulaire à l'emplacement du futur site de division. Un bon nombre de ces composants sont des protéines intrinsèques de membrane dont la fonction précise est inconnue. L'assemblage de ces différentes protéines semble s'opérer selon un ordre hiérarchique initié par la protéine FtsZ. Cependant aucune évidence d'interactions moléculaires directes entre ces différents composants membranaires n'a pu être obtenue jusqu'à présent. Nous avons entrepris de décrypter ces interactions moléculaires par le système double-hybride bactérien. Nos résultats ont mis en évidence un réseau d'interactions multiples entre ces différentes protéines Fts. Ces données contrastent de prime abord le modèle classique de recrutement séquentiel des protéines Fts au niveau du septum par suite d'interactions sélectives entre ces composants. Nous avons pu localiser pour plusieurs composants les régions déterminant la spécificité d'interactions avec leurs partenaires. De plus, nous avons montré que les interactions entre deux protéines Fts hybrides peuvent être modulées (i.e. diminuées ou renforcées) par la co-expression d'une troisième protéine Fts partenaire. L'ensemble des résultats obtenus suggère un modèle alternatif dans lequel de multiples interactions de faible énergie entre les différentes protéines Fts stabiliseraient de façon coopérative l'assemblage de ces molécules dans le septum. Nous avons également identifié de nouvelles protéines capables de s'associer sélectivement avec différentes protéines. Le rôle potentiel de ces composants dans le processus de division cellulaire est en cours d'évaluation.

Légendes des photos :

Figure 1 : Protéine CyaA recombinante comme système vecteur d'antigènes

Un antigène d'intérêt vaccinal (Ag) est greffé génétiquement au sein du domaine catalytique de la toxine CyaA (par ailleurs génétiquement détoxifiée). La protéine recombinante est ciblée, in vivo, sur les cellules dendritiques qui expriment le récepteur spécifique, l'intégrine αMβ2 (j). Dans ces cellules, l'antigène est dégradé et apprêté pour être présenté aux molécules des complexes majeurs d'histocompatibilité de classe I (CMH-I) et de classe II (CMH-II) afin d'activer des lymphocytes T cytotoxiques (CD8+ ) et des lymphocytes T auxiliaires (CD4+ ) spécifiques.

Figure 2 : Système double-hybride bactérien (BACTH), fondé sur la complémentation entre deux fragments de CyaA.

Dans ce système génétique, les protéines d'intérêt (i.e. X et Y) sont fusionnées génétiquement à deux fragments complémentaires du domaine catalytique de CyaA (T25 et T18) et les deux protéines hybrides sont co-exprimées dans une souche E. coli cya (i.e. déficiente en adénylcyclase endogène). L'association des deux protéines hybrides permet une complémentation fonctionnelle des deux fragments T25 et T18 et restaure l'activité enzymatique adénylcyclase. L' AMPc synthétisé, en se liant à la protéine CAP ("catabolite activator protein"), peut activer la transcription de différents gènes, ce qui se traduit par un phénotype Cya+ aisément détectable sur des milieux indicateurs et/ou sélectifs.

Mots-clés: toxine, adénylcyclase, vectorisation, double-hybride, division cellulaire, vaccinologie, biotechnologie


Rapports d'activité 2005 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr