Unité: Biologie cellulaire des Trypanosomes

Responsable: BASTIN Philippe

Les trypanosomes sont des protozoaires flagellés responsables de la maladie du sommeil en Afrique. Ils sont aussi des organismes fascinants à étudier de par la présence de caractéristiques cellulaires uniques. Nous nous intéressons à deux aspects de la biologie du parasite: l'ARN interférence et le flagelle. Nous avons développé plusieurs outils pour l'analyse fonctionnelle par ARNi et avons démontré l'implication de ce processus dans la mitose et le contrôle de l'abondance des ARN dérivant des transposons. Plus récemment, nous avons mis en évidence l'importance de l'activité ARNi pour le contrôle de certains pseudogènes. Nous avons montré que le flagelle est essentiel à la morphogenèse cellulaire et avons caractérisé sa participation à la mobilité de l'organisme. Nous avons identifié plus de 50 gènes encodant des protéines flagellaires et défini leur fonction après extinction par ARNi. Nos données récentes suggèrent que le trypanosome représente un excellent modèle pour l'étude des maladies génétiques liées à des défauts de cils et flagelles.

1. L'ARN interférence chez le trypanosome

(M. Durand-Dubief, S. Ngwabyt, L. Menzer & P. Bastin)

L'ARNi est le système le plus utilisé pour étudier la fonction des gènes chez le trypanosome comme chez de nombreuses autres modèles. Suite à nos études sur la spécificité et l'efficacité de diverses méthodes à générer l'ARNi, nous avons développé deux systèmes de complémentation de mutants ARNi. La complémentation s'effectue, dans le premier cas, via l'expression du même gène mais avec une séquence 3' non traduite différente, et dans le second cas, par l'expression d'un gène hétérologue assez divergent en nucléotides pour échapper à l'ARNi. Cette stratégie peut être adaptée à n'importe quel organisme. Ceci permet de démontrer que le phénotype est bien dû à l'extinction du gène ciblé uniquement, et pas à un effet d'ARNi croisé sur un autre gène et offre des perspectives intéressantes pour les études fonctionnelles (voir ci-dessous).

Nous avons généré une lignée où les deux copies du gène TbAGO1 (une des deux protéines Argonaute de T. brucei) ont été éliminées par double knock-out. Ces cellules sont totalement incapables d'effectuer l'ARNi (quelque soient les méthodes utilisées) mais étaient viables quoique présentant une croissance ralentie. Par contre, l'activité ARNi est restituée après introduction d'une copie supplémentaire du gène TbAGO1 sous forme d'une fusion à la GFP. Celle-ci a permis de localiser la protéine TbAGO1 qui est présente exclusivement dans le cytoplasme et pas dans le noyau. Deux autres phénotypes sont observés en absence d'ARNi : (1) des défauts mitotiques, dus à des problèmes de formation du fuseau et d'ancrage aux chromosomes et (2) une surexpression des ARN de rétro-transposons Ingi et SLACS (apparenté à la famille des LINE).

Les défauts mitotiques initialement observés sont compensés au cours du temps (après plusieurs mois de culture), indiquant que les cellules peuvent, pour cet aspect au moins, s'adapter à l'absence d'ARNi in vitro. Au contraire, la surexpression des ARN de rétroposons s'accentue, mais aucune augmentation de la fréquence de transposition n'a pu être observée, ce qui indique que l'ARNi agirait sur ces deux aspects biologiques de façon différente, peut-être par le biais d'effecteurs spécifiques. Nous avons analysé la transcription des séquences périphériques du transposon ou RIME, apparentés aux éléments SINE, et retrouvées à des endroits bien précis du génome. Les résultats sont spectaculaires : certains petits ARN (0.5 kb) n'apparaissent qu'en présence d'ARNi alors que des ARN de grande taille (5-10 kb) ne sont détectés qu'en absence d'ARNi. L'analyse par RT-PCR a démontré que ces grands transcrits correspondent à des rétroéléments insérés dans des gènes de la famille des RHS (Retrotransposon Hot Spot). Ces gènes de fonction inconnue sont présents en multiples copies dans le génome du parasite, sont très fréquemment retrouvés à proximité des télomères et semblent constituent un site d'intégration privilégié pour les éléments ingi/RIME. Ces données démontrent que l'ARNi est indispensable pour le contrôle de l'expression de ces pseudogènes.

2. Construction et fonctionnement du flagelle

(C. Adhiambo, C. Branche, S. Absalon & P. Bastin)

Nous avons démontré par des analyses fonctionnelles que le flagelle du trypanosome utilise un système semblable aux autres eucaryotes pour sa construction et sa mobilité. Ces expériences valident l'utilisation du trypanosome comme modèle d'étude des défauts génétiques des cils et flagelles. Dans ce cadre, en collaboration avec les équipes de Serge Amselem (Créteil, INSERM U468) et Estelle Escudier (La Pitié, INSERM U492), nous avons étudié la fonction du gène DNAI1, le premier à avoir été démontré être responsable de dyskinésies ciliaires primaires chez l'humain. Par ailleurs, l'inhibition du mouvement flagellaire a des conséquences insoupçonnées jusqu'ici sur le cycle cellulaire du trypanosome, qui pourraient avoir des conséquences intéressantes tant au niveau fondamental que thérapeutique. Tout d'abord, la mobilité est requise pour permettre la séparation des cellules filles à la fin de la cytokinèse, ce phénotype peut être compensé en agitant la culture cellulaire. La mobilité apparaît aussi cruciale pour le positionnement des corps basaux. Ces équivalents du centriole sont des organisateurs importants du cytosquelette en général et leur mouvement lors de la mitose ou de la cytokinèse a été étudié en détail. Nos travaux sont les premiers à démontrer une implication du flagelle dans son propre positionnement. Ces données sont soutenues par le fait que l'inhibition de la formation du nouveau flagelle réduit fortement la migration des corps basaux, de même que la perte d'une structure discrète du cytoquelette impliquée dans la connexion des deux flagelles.

L'assemblage du flagelle est contrôlée par le transport intraflagellaire Tout d'abord, nous avons montré que la réduction du transport intraflagellaire conduit à l'assemblage de flagelles plus courts, démontrant l'importance de ce mécanisme pour le contrôle de la taille du flagelle. Il est frappant de constater que les cellules possédant un flagelle plus court sont plus petites, avec une corrélation directe entre la longueur du flagelle et la taille de la cellule. Une analyse morphométrique détaillée révèle que l'extrémité du nouveau flagelle définit le point d'initiation de la cytokinèse. Ces expériences suggèrent que le flagelle pourrait contrôler la taille cellulaire. Ensuite, lorsque la formation du nouveau flagelle est complètement bloquée, les cellules non-flagellées sont très petites, perdent leur forme et leur polarité cellulaire normale et sont incapables de se diviser. En fait, l'élongation du flagelle contrôle la formation d'autres structures du cytosquelette qui agissent comme organisateurs moléculaires de la cellule. -

Par comparaison de génomes complètement séquencés, plusieurs équipes ont mis en évidence un groupe de gènes présents uniquement chez les espèces ciliées (homme, drosophile) et absents des non ciliées (levures, plantes). Plusieurs de ces gènes sont de fonction inconnue et certains sont associés à des maladies génétiques (Bardet-Biedl, Alström). Nous avons identifié plus de 50 gènes d'intérêt chez le trypanosome, dont 42 ont été clonés et 34 ont été inactivés par ARNi. Des phénotypes spectaculaires au niveau du flagelle ont été observés et sont en cours d'étude. Citons brièvement l'implication de deux nouvelles protéines G dans la construction du flagelle ou encore des perturbations flagellaires multiples dans le cas de ciblage de gènes impliqués dans les maladies de Bardet-Biedl et d'Alström. Vu la complexité du syndrome de Bardet-Biedl, la dissection fonctionnelle de 6 gènes impliqués chez un organisme modèle est une étape importante à la compréhension de la pathologie complexe observée chez l'homme.

Légendes des photos :

Photo 1 : trypanosomes sauvage ou de la lignée TbAGO1-/-, les chromosomes (jaunes) ne sont pas répartis également à la mitose. L'ADN est représenté en bleu.

Photo 2 : trypanosomes dont l'assemblage du flagelle (vert) a été perturbé. L'ADN est représenté en bleu, les corps basaux et le filament d'adhésion en rouge.

Mots-clés: trypanosome, ARN interférence, flagellum, cytosquelette, maladies génétiques


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