Unité: Biologie Cellulaire du Noyau - URA 2582 CNRS

Responsable: Bachellier-Bassi Sophie* ; Nehrbass Ulf***par interim jusqu'au 31/12/05, puis interim par Vincent GALY.

Notre laboratoire étudie les relations structure-fonction au sein du noyau, et plus précisément le rôle régulateur de la position des gènes dans l'espace nucléaire. Nous mettons au point des outils pour suivre la localisation - révélée par microscopie confocale (spinning disk) ou en épifluorescence - de loci discrets ou de régions chromosomiques, au cours du temps et en fonction de leur activité transcriptionnelle. Par ailleurs, nous avons débuté l'étude de la régulation génique liée à l'architecture nucléaire dans les processus de différenciation et de développement de l'organisme modèle Caenorhabditis elegans.

Le laboratoire étudie les relations structure-fonction au sein du noyau, en utilisant les approches suivantes :

1. Nous étudions l'influence de l'architecture nucléaire sur des mécanismes nucléaires (par exemple la régulation de la transcription).

2. Nous étudions l'utilisation de structures nucléaires par des particules rétrovirales dans le ciblage de sites d'intégration.

3. Nous analysons l'effet le rôle de l'architecture nucléaire lors de la différenciation et du développement du nématode.

1. Analyse stucture-fonction de la régulation transcriptionnelle. (S. Bachellier-Bassi, A. Berger, G. Cabal, B. David-Watine, F. Donnadieu, F. Feuerbach, O. Gadal, M. Mhlanga, A. Romano)

1.1. Contribution des machineries de transcription et/ou d'export dans la localisation d'un locus transcrit.

Nous étudions l'effet du positionnement spatial d'un gène dans le noyau sur son l'activation. de ce gène. Les travaux poursuivis actuellement chez Saccharomyces cerevisiae visent à mieux comprendre le rôle de la machinerie de transcription et en particulier du complexe SAGA et de Sac3-Thp1-Cdc31 dans le repositionnement des gènes GAL induits en présence de galactose. Dans ces conditions, le locus GAL voit son mouvement confiné dans une partie du volume nucléaire adjacente à l'enveloppe nucléaire. Ce comportement est stable au cours des 15 minutes d'observation suggérant l'existence d'un ou de plusieurs facteurs localisés à la périphérie du noyau qui ont la capacité de le " retenir " dans ce sous-domaine du noyau. Etant données leur position et leur implication dans l'export des ARN et l'ancrage de la chromatine télomérique, les composants du pore nucléaire constituent des candidats idéaux pour remplir cette fonction. Nous avons commencé l'étude de mutants déficients pour la protéine Nup1 qui interagit avec le complexe Sac3-Thp1-Cdc31.

1.2 Contribution des ARNm à la localisation d'un locus transcrit.

Nous étudions également la position d'un gène de réponse au choc thermique de levure par rapport à la périphérie du noyau. La comparaison de la distribution du gène au sein du volume nucléaire avant et après élévation de la température révèle clairement une localisation plus périphérique de ce locus dans des conditions de température élevée. Ce phénomène n'est pas observé pour un gène dont l'expression n'est pas induite dans ces conditions. Afin de mieux comprendre ce phénomène de relocalisation, nous analysons la localisation du gène de protéine de choc thernmique dans des mutants présentant des altérations de la séquence promotrice de ce gène, abolissant la transcription du gène, ou affectant la capacité d'induction de la transcription en condition de stress sans altérer le niveau de base de la transcription. Par ailleurs, nous analysons l'effet de mutations de composants du pore nucléaire sur le repositionnement du locus en condition de stress.

1.3 L'ADNr comme un élément de l'organisation spatiale du noyau.

La biogénèse du ribosome est initiée au sein d'un domaine nucléaire spécifique : le nucléole. Chez la levure S. cerevisiae, le nucléole est réparti de façon asymétrique au sein du noyau, il est flanque en contact avec l'enveloppe nucléaire et occupe environ un tiers du volume total du noyau. De façon intéressante, nous avons pu montrer que les protéines Mlp1 et Mlp2 sont elles aussi une distribution asymétrique puisqu ‘elles sont absente des pores en contact avec le nucléoletassociées exclusivement aux pores nucléaires nucléoplasmiques. Pour mieux comprendre le rôle du nucléole dans l'architecture spatiale, nous avons étudié une protéine à motif HMG, Hmo1, concentrée la région du génome codant les grands ARN ribosomiques (l'ADNr) et localisée dans le nucléole. Nous avons pu montrer que cette protéine interagit avec l'ADNr et les gènes codant les protéines ribosomiques. Cette interaction nous a conduit à suggérer une architecture nucléaire dépendante du nucléole.

Il a été montré par le groupe de D. Engelke que les gènes codants les ARNt sont transcrits en foyers à proximité du nucléole. Nos données peuvent préliminaires suggérentr que les gènes codant les protéines ribosomiques partagent cette localisation. Afin d'étudier la localisation nucléolaire de l'ensemble de la machinerie de biogenèse de l'appareil de traduction, nous avons développé un algorithme d'analyse d'image en collaboration avec Christophe Zimmer (AIQ) permettant d'étudier la position des gènes par rapport au nucléole en trois dimensions. Nous étudions la position de l'ADNr, et des gènes codants les autres composants de l'appareil de traduction pour tester notre modèle.

2. Interaction entre le virus VIH et INI1 et son rôle dans la détermination des sites d'intégration du virus. (A. Boese, P. Sommer)

Nous avons étudié le rôle de hSNF5/Ini1, un composant du complexe SWI/SNF de remodelage de la chromatine, dans le processus de sélection des sites d'insertion du VIH. Nous avons mis au point un système rapporteur afin de suivre l'activité transcriptionnelle du VIH, et des techniques d'interférence à ARN (RNAi) pour dépléter hSNF5/Ini1 dans les cellules cibles. Ces travaux ont montré que l'intégration du virus est aussi efficace en absence de hSNF5/Ini1 que dans la situation sauvage, mais les provirus intégrés n'ont pas le même potentiel transcriptionnel. Dans le cas d'une intégration en absence de hSNF5/Ini1, l'expression du VIH est augmentée de manière significative dans les premiers jours suivant l'infection, pour redescendre à des niveaux normaux dans les stades ultérieurs. De plus, le promoteur VIH des provirus intégrés en absence de hSNF5/Ini1 présentent une augmentation de diméthylation H3-K9, qui est une signature de répression transcriptionnelle épigénétique. Ces résultats montrent que lors de l'intégration en absence de hSNF5/Ini1, et contrairement à la situation sauvage, le promoteur de VIH est variégué, et ce phénomène est corrélé à une régulation épigénétique particulière. Ces résultats constituent la première indication expérimentale que la préférence de cibles du VIH est liée au contexte chromatinien et qu'un partenaire cellulaire de l'intégrase, en l'occurrence hSNF5/Ini1, confère la spécificité du mécanisme de sélection de la cible.

3. Organisation structurale et fonctionnelle du noyau au cours du développement de C. elegans. (V. Galy)

C. elegans est un modèle animal de choix pour l'étude des mécanismes de formation de l'enveloppe nucléaire, du rôle de celle-ci dans l'organisation architecturale du noyau et sa contribution dans la régulation et "l'imprinting" des gènes au cours du développement. L'une des protéines candidates pouvant jouer un rôle dans l'organisation nucléaire du nématode est l'orthologue de la protéine Tpr des vertébrés et des Mlp de S. cerevisiae.

Nous avons donc identifié et commencé l'analyse fonctionnelle de l'orthologue de Tpr qui est localisée à l'enveloppe nucléaire mais également en faible proportion dans le nucléoplasme, ce qui est comparable aux observations réalisées pour les orthologues humain ou de Drosophile. Par ailleurs Ce-TPR semble localisé sur le fuseau mitotique en métaphase et début d'anaphase. Ce marquage est similaire au marquage de la matrice du fuseau mitotique décrit précédemment pour la protéine de Drosophile. Par ailleurs, la caractérisation préliminaire du phénotype induit par l'inactivation de Ce-TPR par RNAi suggère que la baisse importante de la quantité de Ce-TPR dans les embryons provoque l'arrêt du développement au stade larvaire d'une partie de la descendance des vers traités, ainsi que des problèmes morphologiques des vers qui échappent à cet arrêt. Nous avons optimisé les conditions d'acquisitions d'images en microscopie à contraste de phase pendant les 7 premières heures du développement de C. elegans, afin de permettre de caractériser les altérations de développement.

Mots-clés: architecture nucléaire, régulation de l'expression des gènes


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