Unité: Biochimie et de Biologie Moléculaire des Insectes

Responsable: Charles ROTH par intérim

Notre Unité se concentre sur trois thèmes de recherche ayant des liens avec la glande salivaire : 1) l'annotation du génome d'Anopheles gambiae, 2) le transcriptome et le protéome de la glande salivaire et leur variation en présence des parasites 3) les effets de la salive dans la transmission de Plasmodium entre le moustique et l'hôte animal. Notre but est de mieux comprendre comment les parasites du paludisme interagissent avec leurs insectes hôtes, afin de trouver d'éventuelles solutions pour interrompre ou réguler cette interaction.

Génomique d'Anopheles gambiae (Charles Roth, Karin Eiglmeier, Shawn Gomez, Inge Holm, Pierre Dehoux, Kim Chaveroche)

Notre unité a participé à un consortium international qui a réalisé le séquençage du génome de Anopheles gambiae (Science, 2002, 4 octobre, 298 (5591) : 129-49), principal vecteur du paludisme et à un autre consortium international qui est entrain de séquencer le génome de Aedes aegypti, principal vecteur de la fièvre de la dengue. La séquence, longue de 278 millions de paires de bases, recouvre environ 90% du génome de A. gambiae et coderait plus ou moins pour 15 000 gènes. Notre groupe travaille sur l'amélioration de l'exactitude des gènes et de l'annotation des protéines codées au moyen de banques de cDNA " full-length ". Nous focalisons nos recherches sur l'étude des gènes exprimés dans les glandes salivaires du moustique et d'une manière plus générale, sur la détermination des protéines secrétées par A. gambiae. On attend que la séquence de A. aegypti soit 5X plus longue et nous avons également séquencé des ADNc du A. aegypti. Les études comparatives entre les deux moustiques vont aider à mieux identifier et comprendre les protéines exprimées dans la glande salivaire et leur rôle dans le parasite maturation et transmission. Ces études permettront également d'établir une prédiction des capacités d'interaction entre les diverses protéines du moustique ou entre le moustique et le parasite dans la glande salivaire et d'envisager celles pouvant être des cibles pour l'inhibition de la transmission du parasite.

Variations du transcriptome des glandes salivaires d'Anopheles gambiae au cours de leur infection par Plasmodium (Isabelle Rosinski-Chupin, Sylvie Perrot et Paul Brey)

Avant sa réinjection chez un hôte humain lors de la piqûre, le Plasmodium agent du paludisme, doit traverser l'épithélium salivaire du moustique. Cet épithélium constitue une barrière biologique susceptible de réagir à la présence du parasite. Afin d'explorer l'étendue de ces réactions cellulaires et leurs conséquences à la fois sur la composition de la salive et sur la survie du parasite, nous avons entrepris la caractérisation du transcriptome des glandes salivaires d' Anopheles gambiae et de ses modifications en réponse à la présence de Plasmodium, en utilisant la technique SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Plusieurs banques SAGE, correspondant à différentes périodes au cours de l'infection des glandes d' A. gambiae par P. berghei ont été obtenues. La comparaison de ces banques ont permis de mettre en évidence différents gènes dont l'expression est modifiée au cours de l'infection. La caractérisation fonctionnelle de ces gènes et l'étude de leur rôle dans les interactions Anopheles/Plasmodium sont en cours. Ces études font partie du Grand Programme Horizontal Anopheles développé à l'Institut Pasteur.

Rôle des interactions Plasmodium/épithélium salivaire dans l'augmentation du caractère infectieux du sporozoite (Thomas Chertemps, Sylvie Perrot, Anna Raibaud et Isabelle Rosinski-Chupin)

La période de stockage du sporozoite dans les glandes salivaires est accompagnée d'une augmentation du pouvoir infectieux et de modifications de l'expression génique chez le parasite, modifications qui ont pu être mises en évidence notamment lors de l'étude SAGE. Nous cherchons à déterminer dans quelle mesure l'interaction Plasmodium/épithélium salivaire est responsable de la modulation du programme génétique chez Plasmodium par une étude cinétique détaillée de l'expression des gènes caractéristiques du sporozoïte infectieux.

Analyse protéomique de la salive et des glandes salivaires d'Anopheles gambiae (Valérie Choumet, Virginie Jan, Annick Carmi, Annie Robbe-Vincent)

Notre équipe procède à l'analyse protéomique de la salive et des glandes salivaires d'Anopheles gambiae. Il est en effet maintenant admis que la salive des arthropodes influence la transmission des agents pathogènes qu'elle contient (virus, bactéries, parasites). L'étude de sa composition devrait fournir de nouvelles cibles vaccinales dans la prévention et le traitement du paludisme. Par ailleurs, la salive des insectes hématophages contient une grande variété de peptides et de protéines dont la grande spécificité d'action les rend très attractifs en tant qu'outils pharmacologiques pour disséquer certains mécanismes physiologiques et proposer de nouveaux médicaments ou tests de diagnostic. L'analyse protéomique descriptive est réalisée en collaboration avec la plate-forme " Protéomique " et la plate-forme d'Analyse et de Microséquençage des Protéines de l'Institut Pasteur. Nous avons ainsi pu identifier 86 composants à partir d'extraits de glandes salivaires de jeunes femelles gorgées, 46% d'entre eux étant des protéines de la salive (vasodilatateurs, allergènes, enzymes de digestion des sucres et proteines de functions inconnues). Dans le cadre du protéome fonctionnel, notre équipe focalise ses efforts sur la caractérisation des molécules impliquées dans la prise du repas sanguin. Les effets des composants des glandes salivaires sur les protéines de la cascade de coagulation ont été caractérisés. La cinétique et la nature des effets pro-inflammatoires ont été étudiées sur un modèle murin en collaboration avec l'Unité de Recherche et d'Expertise Histotechnologie et Pathologie. Le criblage des activités pharmacologiques a permis de mettre en évidence un ensemble d'activités encore jamais décrites dans la salive d'anophèle. D'une façon générale, les glandes salivaires de moustiques contiennent des composés inhibiteurs de facteurs actifs tels que : la kallikréine, le FXa, la thrombine et la protéine Ca, l'urokinase et la plasmine. La composition des glandes salivaires varie selon l'âge de la femelle, selon qu'elle ait pris un repas sanguin ou non et selon qu'elle soit infectée par Plasmodium. L'identification ainsi que la caractérisation du mécanisme d'action des protéines impliquées dans ces effets pharmacologiques pourraient permettre leur utilisation en tant qu'outils pour disséquer certains mécanismes physiologiques et proposer de nouveaux médicaments ou tests de diagnostic. Par ailleurs, certains composants pourraient fournir de nouvelles cibles dans le cadre d'études de transgénèse du moustique vecteur pour une meilleure compréhension de l'interaction hôte vecteur/parasite.

Identification de gènes différentiellement exprimés chez le stade ookinète de Plasmodium berghei (A. Raibaud)

L'ookinète est le stade de Plasmodium qui envahit le tube digestif du moustique. Nous avons construit une banque Suppression Subtractive Hybridization (SSH) de cDNA d'ookinète, soustrait par de cDNA de zygote, le stade de développement précédent. Des clones spécifiques à l'ookinète ont été sélectionnés par un criblage différentiel de la banque. La séquence de ces clones présentait une forte homologie avec Plasmodium yoelii. Grâce au séquençage du génome et l'annotation des gènes de P. yoelii, des clones d'ookinète ont pu être associés à des orthologues différents de P. yoelii.

Nous avons comparé le niveau des transcrits de l'ookinète  et du zygote et montré que tous les gènes sont différentiellement exprimés chez l'ookinète. Pour 14 des 15 gènes, c'est la première évidence de transcription chez l'ookinète. Quatre gènes sont exprimés aussi chez d'autres stades invasifs de Plasmodium : le sporozoïte et/ou le mérozoïte, ce qui suggère qu'ils codent pour des protéines avec une fonction commune pour invasions.

10 des 15 gènes codent pour des protéines, donc la fonction peut être prédite. Certaines jouent un rôle dans l'invasion de l'ookinète, comme la MACPF (membrane-attack complex/perforin). D'autres gènes codent pour des protéines régulatrices. Un exemple est une P-ATPase, transporteur des ions ; un autre gène code pour une protéine kinase Ca-dépendante (CDPK). Les CDPKs peuvent être essentielles pour la mobilité et l'invasion du parasite. Encore d'autres gènes codent pour des protéines de défense, comme la thioredoxine.

Ecologie évolutionniste de Plasmodium et les stratégies de transmission parasitaire (Richard Paul et Ramatoulaye Lawaly)

La transmission de Plasmodium de l'hôte vertébré au vecteur d'insecte s'effectue par les stades sexuels, les gamétocytes. La production des gamétocytes semble être liée à l'état de hématologique de l'hôte et suggère que le parasite soit capable d'investissement facultatif adaptatif. Il semble que le parasite change sa production de gamétocytes afin d'assurer sa fécondation. Une telle stratégie adaptative recommande un rôle important pour assurer la fécondation du parasite, qui peut être surtout importante quand les densités de gamétocyte sont très basses. Dans les régions où la transmission est saisonnière, les parasites de paludisme survivent chez l'homme en tant qu'infections chroniques qui rendent les parasites capable de survivre pendant la saison non transmission et sont la source de gamétocytes, infectant les moustiques dès leur retour. La fragilité du processus de transmission des infections de gamétocyte de basse densité et les réponses apparemment adaptatives pour assurer sa fécondation, suggéreraient que l'évolution phénotypique gamétocytaire est formée en grande partie, par la pression à transmettre des infections chroniques. La première étape est d'identifier les pressions sélectives majeures dans une approche constructive au contrôle de la maladie. La production adaptative de gamétocytes, selon la saison, a été suggérée pour des Plasmodium spp. en régions tempérées ainsi que d'autres haemosporidia. Les résultats d'une analyse qualitative de données historiques suggèrent que P. falciparum peut répondre aussi aux caractères indicateurs saisonniers, notamment l'augmentation saisonnière soudaine des piqûres de moustique non infecté (par Plasmodium) (Paul et al. 2004). En effet, les résultats préliminaires démontrent une corrélation forte entre les piqûres de moustiques et la tendance d'une infection à produire les gamétocytes. Actuellement, nous explorons l'implication de la réponse allergique (IgE) dans ce phénomène.

Mots-clés: insect vectors, malaria, paludism, salivary gland, transcriptome, SAGE, proteome, parasite transmission


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