Unité: Bactéries anaérobies et Toxines

Responsable: Popoff Michel R.

Régulation de la toxinogénèse chez Clostridium botulinum et Clostridium tetani; évidence que BotR/A et TetR sont des facteurs sigma alternatifs contrôlant l'expression des gènes de la neurotoxine et des protéines associées. Régulation de la production de toxine Beta12 chez C. perfringens. Etude des toxines clostridiennes de grande taille qui glucosylent des Rho et Ras GTPases; voies de signalisation impliquées dans le contrôle de la polymérisation de l'actine et des jonction intercellulaires.

Le CNR Bactéries anaérobies et botulisme est impliqué dans la surveillance du botulisme et l'identification des souches de bactéries anaérobies (voir CNR bactéries anaérobies et botulisme).

BotR/A et TetR sont des facteurs sigma alternatifs contrôlant l'expression des gènes de la neurotoxine et des protéines associées chez Clostridium botulinum A et Clostridium tetani

Clostridium botulinum et Clostridium tetani produisent de puissantes toxines, la neurotoxine botulique (BoNT) et la toxine tétanique (TeNT), respectivement, qui sont responsables de maladies sévères, le botulisme et le tétanos<. La synthèse de neurotoxine st une processus régulé chez Clostridium. Les gènes botR/A chez C. botulinum A et tetR chez C. tetani régulent positivement l'expression des gènes codant pour BoNT/A et les protéines non toxiques associées (ANTPs), ainsi que TeNT respectivement. Le gène botR/A est localisé à proximité de deux opérons qui contiennent les gènes bont/A et antps chez C. botyulinum A, et tetR précède immédiatement le gène tetx chez C. tetani. Nous avons montré que BotR/A et TetR agissent comme des facteurs sigma alternatifs plutôt que comme des régulateurs positifs d'après les résultats suivants: i) BotR/A et TetR s'associent à l'ADN cible seulement en présence du core enzyme de la RNA polymerase (Core); ii) BotR/A et TetR se fixent sur le core enzyme; iii) BotR/A-Core reconnaît les régions -35 et -10 du proomoter ntnh-bont/A, at iv) BotR/A et TetR stimulent la transcription in vitro des promoters cibles. Chez C. botulinum A, les gènes bont/A et antps sont transcrits comme des opréons bi- et tri-cistroniques sous le contrôle de BotR/A. BotR/A et TetR sont certainement apparentés à un nouveau de facteurs sigma de la famille 70 incluant TcdR et UviA, qui régulent respectivement la production des toxines A et B de C. difficile et une bactériocine chez C. perfringens. Les séquences des régions -35 sont hautement conservées dans les promoteurs des gènes cibles des toxines chez C. botulinum, C. tetani, C. difficile et C. perfringens. Ainsi, un mécanisme commun de régulation contrôle probablement l'expression des gènes de toxines chez ces quatre espèces de Clostridium.

Expression induite par antibiotique du gène de la toxine Beta2 de Clostridium perfringens (cpb2) chez les souches toxinogènes d'origine équine

Le gène de la toxine Beta2 (cpb2) des souches de Clostridium perfringens isolées de chevaux, bovins, ovins, porcs et homme a été séquencé. Le gène cpb2 des souches d'origine équine et des autres espèces excepté le porc, diffère de celui des souches porcines par l'absence d'une adénine dans une séquence de polyA immédiatement en aval du codon initial présente chez toutes les souches de C. perfringens non porcines. Cette délétion entraîne la formation d'un gène cryptique portant un codon stop prématuré seulement après les 9 premiers codons, alors que la toxine Beta2 entière contient 265 acides aminés. La technique d'immunoblots à l'aide d'anticorps préparés contre la toxine beta2 recombinante a révélé l'absence d'expression du gène cpb2 chez les souches de C. perfringens d'origine équine et les autres souches non-porcines dans des conditions de culture standard. Cependant, l'addition d'aminoglycoside tel que gentamycine ou streptomycine était capable d'induire l'expression de cpb2 chez un groupe représentatif de souches d'origine équine, probablement par changement de phase. La présence de la toxie Beta2 a été révélée par immunohisotlogie dans des échantillons du petit et gros intestin de chevaux atteints de typhlocolite sévère qui avaient été traités auparavant avec de la gentamycine. Ce résultat explique le fait que le traitement antibiotique des chevaux contaminés par une souche toxinogène de C. perfringens Beta2 conduit à une évolution grave et fatale de la typhlocolite équine. Les observation cliniques montrent une réduction des typhlocolites graves chez les chevaux admis en soins hospitaliers pour troubles intestinaux depuis que l'utilisation de gentamycine a été abandonnée. C'est le premier rapport de l'expression d'une gène de toxine bactérienne induite par un antibiotique produisant un changement de phase dans la traduction des codons en acides aminés au niveau des ribosomes.

Modification de la perméabilité et des jonctions intercellulaires de la barrière de cellules épithéliales par les toxines létales de Clostridium sordellii

La toxine létale de Clostridium sordellii (LT) est une glycotransferase qui inactive les GTPases de la famille Rho et Ras. Dans le présent travail, nous avons étudié les effets de deux variants, LT82 et LT9048, sur l'intégrité de la barrière de cellules épithéliales en utilisant des cellules MDCK ou MCCD polarisées. Nos résultats montrent pour la première fois que le toxines LTs ont un effet limité sur les jonctions serrées, alors que les deux toxines modifient altèrent la perméabilité paracellulaire en 2-4 h. De façon concomitante, LT82 et LT9048 induisent une désorganisation des filaments d'actine basolatérale, sans modifier l'actine apicale (Photo 1). Les deux toxines affectent principalement les jonctions adhérentes en mobilisant les complexes de E-cadherine-catenine de la membrane vers le cytosol. des effets similaires sur les jonctions adhérentes ont été observés avec d'autres toxines bactériennes, qui directement ou indirectement dépolymérisent les filaments d'actine. Ainsi, Rac, un substrat commun à LT82 et LT9048, joue probablement un rôle central dans l'altération des jonctions adhérentes induite par LTs. Nous avons montré que la perturbation des jonctions adhérentes induites par LTs ne résulte pas d'un effet direct des toxines sur les protéines des jonctions adhérentes et ni d'une signalisation de Rac indépendante de l'actine, mais plutôt d'une désorganisation du cytosquelette d'actine basolatérale dépendant de Rac. Ces résultats supportent qu'un équilibre dynamique de des filaments d'actine corticale est essentiel pour l'organisation fonctionnelle des jonctions à E-cadhérine dans les épitheliums.

Utilisation des toxines qui ciblent les RhoGTPases ou l'actine monomérique pour disséquer des processus physiologiques cellulaires impliquant la régulation du cytosquelette d'actine tel que la modulation de la morphologie des cellules musculaires lisses par l'AMP cyclique en inhibant une voie de signalisation indépendante de Rac, effets complémentaires de ERK2 et p38 dans l'adhésion plaquetaire, rôle des RhoGTPases (principalement Cdc42) impliqués dans la dynamique de l'actine corticale dans la sortie cellulaire de HIV-1, et particpation à la caractérisation d'une nouvelle GAP spécifique de RhoA et Cdc42 qui contrôle les jonctions à E-cadhérine et a un rôle clé dans l'entrée de Listeria monocytogenes.

Oribacterium sinus gen. nov., sp. nov., de la famille "Lachnospiraceae" (phylum Firmicutes) (Carlier JP, K'Ouas G, Bonne I, Lozniewski, Mory F. Int J Syst Evol Microbiol. 2004, 54: 1611-1615)

Un bacille anaérobie inconnu isolé d'un échantillon de pus de sinus chez un jeune enfant young child (strain AIP 354.02T) a été caractérisé par des méthodes phénotypiques et génotypiques (Photo 2). Le séquençage du gène ARN ribosomal 16s indique que ce gène est affilié phylogénétiquerment à d'autres gènes dont les séquences ont été déposées dans les bases de données. D'après le séquençage du gène ARN 16s, ces bactéries non cultivables ainsi que la souche AIP354.02T forment un sous groupe distinct appartenant à la famille des Lachnospiraceae au sein du phylum Firmicute. Oribacterium gen. nov. est proposé pour ce groupe de microorganismes et Oribacterium sinus gen. nov. sp. nov. pour la souche AIP354.02T (=CIP 107991T=CCUG 48084T).

Légendes des photos :

Photo 1. Les deux variants de toxine léthale de Clostridium sordellii, LT82 et LT9048, désorganisent préférentiellement les filaments d'actine baso-latérale, tandis que l'architecture de l'actine apicale des monocouches de cellules MDCK polarisées est préservée.

Photo 2. Microcopie électronique en transmission de Oribacterium sinus gen. nov. sp. nov. AIP 354.02T. (a) morphologie générale en coloration négative; (b) section ultrafine montrant la paroi de bactérie Gram-positive (CW) et la membrane cytoplasmique (CM). Barres, (a) 500 nm; (b) 100 nm.

Mots-clés: Clostridium, botulisme, toxines, Rho-GTPases, cytosquelette, actine


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