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     Virus Lents - CNRS URA 1930


  Responsable : BRAHIC Michel (mbrahic@pasteur.fr)


  resume

 

L'Unité a deux domaines d'activité : la neurovirologie et le SIDA. Nous étudions l'infection de la souris par le virus de Theiler, un des meilleurs modèles pour la sclérose en plaques. Nous développons un candidat vaccin contre le VIH, et d'autres virus humains, en utilisant le vaccin rougeole comme vecteur. Nous étudions la régulation de la fonction thymique au cours de la primo-infection par le VIH et le VIS. Nous développons une approche à haut débit pour caractériser les interactions entre protéines virales et protéines de l'hôte.



  rapport

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1- Pathogénie de l'infection par le virus de Theiler (Michel Brahic, Jean-François Bureau)

Le virus de Theiler, un picornavirus, infecte le système nerveux central de la souris de façon persistante. Le virus infecte d'abord les neurones, puis persiste dans les cellules gliales de la substance blanche, en particulier dans les oligodendrocytes, cellules qui synthétisent la myéline, et dans les macrophages infiltrants. L'infection s'accompagne d'inflammation chronique et de lésions démyélinisantes qui ressemblent de près aux lésions de la sclérose en plaques.

Le virus ne persiste pas chez les souris C3H shiverer et rumpshaker, souris porteuses de mutations dans deux gènes de structure de la myéline. Nous utilisons cesLes souris pour définir le rôle de la myéline et/ou de l'oligodendrocyte dans l'infection persistante. Ces souris sont résistantes à l'infection perNous avons montré que la résistance à l'infection persistante n'était pas due au système immunitaire ni a une différence de permissivité des corps cellulaires des oligodendrocytes et des macrophages mutants. sistante, suggérant que l'oligodendrocyte et/ou la myéline joue(nt) un rôle clé dans la persistance. MBP et PLP sont aussi exprimées, à des taux très faibles, par les macrophages. La résistance pourrait donc être due aussi à des altérations de l'interaction virus/macrophage. Cependant, in vitro, nous avons observé que les oligodendrocytes et les macrophages des souris C3H et des souris mutantes ont la même permissivité au virus. LaNous testons l'hypothèse selon laquelle la résistance est due aux anomalies de la myéline des souris mutantes en inoculant le virus au niveau de la rétine et en suivant son cheminement dans le nerf optique. Chez les souris sauvages, le virus infecte les neurones de la rétine puis est retrouvé quelques jours plus tard dans la myéline et les corps cellulaires d'oligodendrocytes (Figure 1)., Les cellules gliales du nerf controlatéral ne s'infectent pas, démontrant que l'infection ne se fait pas par voie hématogène. Chez les souris C3H shiverer, l'infection des oligodendrocytes est considérablement réduite. Nous examinons le rôle des contacts axone/myéline dans l'infection des oligodendrocytes.

La sensibilité des souris à l'infection persistante et à la maladie démyélinisante est multigénique. Les différences de sensibilité sont principalement liées au contrôle de la charge virale par le système immunitaire. Tmevp3 est un locus de sensibilité que nous avons identifié sur le chromosome 10. L'intervalle génétique correspondant à ce locus a été réduit a 500 Mb. Il contient 4 gènes, Mdm1, Il-22, Ifng (interféron gamma) et Tmevpg1 un " nouveau " gène codant pour un ARN non-codant qui a son équivalent chez l'homme et qui pourrait être impliqué dans la régulation de l'expression de l'interféron gamma (Figure 2). Plusieurs polymorphismes existent dans les régions promotrices de ces gènes, suggérant que l'effet de Tmevp3 est dû à des différences dans la régulation de l'expression génique. L'induction de l'expression de Ifng et de Il-22 dans des lymphocytes ex vivo varie en fonction de ces polymorphismes. Il est à noter que l'équivalent humain de Tmevp3 a été impliqué dans la sensibilité à plusieurs maladies auto-immunes, y compris la sclérose en plaques.

2- Mise au point de vaccins bivalents dérivés du vaccin contre la rougeole (Frédéric Tangy)

Les souches atténuées du virus de la rougeole sont d'excellents vaccins qui peuvent être transformés en vecteurs pour exprimer des gènes étrangers. La souche vaccinale Schwarz a été clonée et transformée en vecteur par addition de deux unités de transcription supplémentaires. Des vaccins recombinants exprimant le géne Env du VIH 89.6 dont les boucles hypervariables V1, V2 et ont été délétées isolément ou dans différentes combinaisons, induisent des réponses T et des anticorps neutralisants après une seule injection à des souris transgéniques pour le recepteur de la rougeole. Les sérums neutralisent 90-100 % de l'infectivité d'isolats primaires du VIH à la dilution 1/100. Ces taux sont supérieurs à ceux de sérums humains neutralisants de référence. Après 2 injections, les taux d'anticorps anti-VIH obtenus chez des souris naïves et des souris pré-immunisées contre la rougeole sont comparables. Le même résultat a été obtenu chez des singes macaques un an après la pré-immunisation contre la rougeole. Ces résultats indiquent que des vaccins rougeole recombinants pourraient être utilisés chez des individus possédant déjà une immunité anti-rougeole.

Une expérience d'immunisation-épreuve a été réalisée chez 12 macaques avec un mélange de vecteurs rougeole exprimant les protéines Gag, Env, Tat, Nef du virus chimérique SHIV89,6. Des réponses cellulaires spécifiques ont été induites chez tous les singes immunisés, et des anticorps neutralisants chez certains d'entre eux. De fortes réponses anamnestiques cellulaires et humorales, ainsi qu'une réduction de la charge virale d'un facteur 100 à 1000, ont été observées après épreuve des animaux vaccinés.

Un vecteur rougeole exprimant un immunogène du VIH destiné à l'induction de réponses cellulaires CD4/CD8 est en cours de développement clinique en collaboration avec GlaxoSmithKline Biologicals. L'expression du transgène et son immunogénicité ont été testés chez la souris. Le programme clinique prévoit un essai de phase I chez des volontaires sains séronégatifs pour la rougeol pour confirmer l'absence de toxicité du vaccin et étudier sa sécrétion par les vaccinés. Un essai de phase I/II testera le niveau d'induction de cellules CD4 et CD8 spécifiques du VIH chez des volontaires sains ayant une immunité préexistante contre la rougeole.

Nous testons des vaccins rougeole recombinants exprimant des protéines de flavivirus (virus de la dengue, du Nil occidental, de la fièvre jaune, de l'encéphalite japonaise). Le vaccin exprimant la forme sécrétée de la protéine d'enveloppe du virus du Nil occidental iinduit une immunité protectrice stérilisante 8 jours après une seule injection. Ce candidat vaccin est testé chez le singe. Dans le cas de la dengue, un candidat vaccin tétravalent contre les 4 sérotypes est en cours d'évaluation.

3- Homéostasie lymphocytaire T et infections virales (Rémi Cheynier)

L'homéostasie des cellules T naïves est maintenue grâce à une régulation fine de leur production, de leur prolifération, de leur survie et de leur mort. Le thymus est l'organe essentiel qui assure la production de ces cellules, y compris chez l'adulte. Au cours des infections, le maintien de la diversité du répertoire T doit se faire malgré les perturbations majeures engendrées par la réponse spécifique à l'agent. Nous analysons ces régulations au cours de l'infection aiguë par le SIV et par le virus de la rougeole. Nous avons mesuré la production thymique et la prolifération périphérique des cellules T chez le macaque Rhésus infecté par ces virus. Le virus de la rougeole induit, dans les premiers jours, une augmentation du nombre de lymphocytes T naïfs périphériques, due à une augmentation de la production thymique et de la prolifération périphérique. Dans le cas du SIV, on observe aussi une augmentation de la prolifération périphérique mais pas d'augmentation de la production thymique. Il est donc probable que l'infection par les virus du SIDA induise, dès le début, une diminution de la diversité du répertoire T qui limite les possibilités de réagir à d'autres pathogènes. Nous analysons les causes de l'inhibition de la fonction thymique par les virus du SIDA ainsi que les conséquences de cette inhibition sur la diversité du répertoire T naïf. Enfin, nous évaluons la possibilité d'utiliser l'IL-7 recombinante pour restaurer l'homéostasie lymphocytaire T chez les macaques infectés par le SIV.

4- Cartographie haut-débit des interactions entre protéine virales et cellulaires (Pierre-Olivier Vidalain)

Nous avons initié le programme I-MAP de cartographie à haut débit des interactions entre protéines virales et cellulaires, en collaboration avec avec Y. Jacob (Institut Pasteur, Paris), C. Rabourdin-Combe et V. Lotteau (IFR-128 BioSciences de Lyon). Ce programme repose sur la création d'une collection d'ORFs virales dans un système de clonage par recombinaison (Gateway™) et sur une plate-forme de criblage à haut débit des interactions protéine-protéine par double-hybride en levure.

Nous utilisons actuellement cet outil pour identifier les cibles cellulaires de plusieurs paramyxovirus, dont le virus de la rougeole, les virus Nipah, Hendra et le Metapneumovirus humain (hMPV). Bien que tous entrent dans l'organisme par la voie respiratoire, leur virulence et leur capacité à se propager dans l'organisme varient considérablement. Alors que le virus respiratoire syncitial et le hMPV sont responsables d'inflammations limitées aux voies respiratoires, le virus de la rougeole, les virus Nipah et Hendra sont capables de se propager à différents organes, y compris au système nerveux central. La comparaison des cartes d'interactions avec l'hôte entre ces différents virus doit mettre en évidence, au niveau moléculaire, des étapes spécifiques de leur pouvoir pathogène respectif. Un travail réalisé sur deux souches, l'une sauvage et l'autre vaccinale, du virus de la rougeole nous a déjà permis de montrer la pertinence de cette approche pour l'identification d'interactions impliquées dans la virulence. Du fait de leur proximité phylogénétique, il est probable que les paramyxovirus partagent un certain nombre de mécanismes pour inhiber la réponse antivirale de l'hôte. Ces mécanismes communs, constituent des cibles thérapeutiques originales pour de futurs antiviraux génériques.

Outre ce travail propre à l'Unité, nous collaborons avec plusieurs équipes du campus pour appliquer la même démarche aux protéines d'autres familles virales.

Figures :

Figure 1 : Un oligodendrocyte infecté dans le nerf optique d'une souris, 4 jours après inoculation intra-oculaire par le virus de Theiler. Rouge : anticorps antiviral. Vert : anticorps anti-CNPase (un marqueur d'oligodendrocyte). Bleu : noyaux de cellules marqués avec du DAPI.

Figure 2 : Carte génétique du locus de susceptibilité Tmevp3.

Figure 3 :Virus de la rougeole (souche vaccinale Schwarz) exprimant les protéines d'enveloppe du HIV

Mots-clés: Virus de Theiler, Vaccin anti-VIH, Virus neurotropes, Paramyxoviridae, Thymus, Pathogénie



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  GAU Mireille (mgau@pasteur.fr) BRAHIC Michel, CNRS/IP (Directeur de Recherche I, Professeur, mbrahic@pasteur.fr)

BUREAU Jean-François, IP (Chef de Laboratoire, jfb@pasteur.fr)

CHEYNIER Rémi, IP (Chargé de Recherche, remi@pasteur.fr)

FEVRIER Michèle, CNRS (Chargée de Recherche I, mfevrier@pasteur.fr)

TANGY Frédéric, CNRS (Directeur de Recherche II, ftangy@pasteur.fr)

VIDALAIN Pierre-Olivier, CNRS (Chargé de Recherche II, vidalain@pasteur.fr)
BEQ Stéphanie, Post-doc

BRANDLER Samantha, Thèse

CAIGNARD Grégory, Master

FLYNN David Neilson, Boursier Fulbright

GAUTIER David, Thèse

GUERBOIS Mathilde, Thèse

KARACHTCHOUK Galina, Post-doc

LORIN Clarisse, Thèse

MAS Magali, Post-doc

ROUSSARIE Jean-Pierre, Thèse

SCHILTE Clémentine, Master

VOLMER Romain, Thèse

COMBREDET Chantal (Technicienne Supérieure de Laboratoire, combred@pasteur.fr)

LEVI-ACOBAS Fabienne (Technicienne Supérieure de Laboratoire, flacobas@pasteur.fr)

LEVILLAYER Florence (Technicienne Supérieure de Laboratoire, flevilla@pasteur.fr)

NAJBURG-LABROUSSE Valérie (Technicienne Supérieure de Laboratoire, vlabrous@pasteur.fr)

SYAN Sylvie (Technicienne Supérieure de Laboratoire, ssyan@pasteur.fr)


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