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     Spirochètes (Laboratoire des)


  Responsable : Isabelle SAINT GIRONS (isgirons@pasteur.fr)


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Un système de mutagénèse aléatoire a été développé chez Leptospira interrogans, agent de la leptospirose. La détermination de la séquence du prophage LE1, réplicon extra-chromosomique d'une souche saprophyte de Leptospira biflexa, a été accompagnée de la caractérisation de ses fonctions de réplication et de partition. Le typage des leptospires, par l'utilisation des mini satellites (VNTR), qui s'est révélé performant pour identifier la plupart des sérovars de Leptospira interrogans, est en cours d'application au Centre National de Référence des Leptospires. Une méthode (MLSA) plus accessible et plus performante que la méthode actuelle de référence a été mise au point pour la définition de nouvelles espèces de Borrelia. Pour la borréliose de Lyme, deux aspects épidémiologiques ont été abordés : l'incidence clinique de la maladie humaine et l'étude de la densité du vecteur (la tique, Ixodes ricinus) et son taux d'infection par Borrelia burgdorferi.



  rapport

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LEPTOSPIRES

Séquençage du génome du leptophage LE1 et identification de ses fonctions de partition et de réplication (P. Bourhy1, L. Frangeul2, E. Couvé3, P. Glaser3, I. Saint Girons1 et M. Picardeau1)

1 Laboratoire des Spirochètes, 2 Plateau Technique 4 - Intégration et Analyse Génomique, 3 Unité de Recherche de Génomique des Microorganismes Pathogènes, Institut Pasteur, Paris, France.

L'unique réplicon extra-chromosomique isolé chez les leptospires est le prophage LE1 de Leptospira biflexa. A l'état de prophage, LE1 se réplique sous forme circulaire chez L. biflexa. Le génome de LE1, d'une taille de 74 kb, a été entièrement séquencé permettant l'identification de 79 ORF dont la majorité présente peu de similarités avec des protéines de fonctions connues. L'organisation génétique de certains gènes et l'étude de leur profil d'expression à l'état de prophage ou lors de la phase lytique permet cependant de déterminer des groupes de gènes qui pourraient coder pour des protéines structurales du phage ou des protéines de l'immunité. De plus, l'analyse du biais en GC permet de déterminer l'origine de réplication de LE1 et suggère que LE1 se réplique via une réplication bidirectionnelle de type à partir de cette origine unique. Des expériences de mutagénèse et de sous-clonage ont permis d'identifier les différents déterminants génétiques responsables de la réplication et de la partition : un gène rep, un opéron parAparB et des séquences répétées. Ces résultats devraient permettre la construction de nouveaux vecteurs pour l'étude génétique des leptospires, ainsi qu'une meilleure compréhension de la génétique des phages bactériens.

Développement d'un système de mutagénèse aléatoire chez L. interrogans, agent de la leptospirose (P. Bourhy, H. Louvel, I. Saint Girons et M. Picardeau)

Laboratoire des Spirochètes, Institut Pasteur, Paris, France.

En utilisant un vecteur non réplicatif chez les leptospires portant d'une part le transposon Himar1 contenant une cassette de résistance à la kanamycine et d'autre part une transposase hyperactive (Lampe et al., 1999), nous avons obtenu de nombreux mutants (5 104 transformants/µg d'ADN), après électroporation des leptospires saprophytes. En utilisant le même vecteur, nous avons montré qu'il était possible d'obtenir la transposition aléatoire du transposon dans le génome des leptospires pathogènes. Ainsi, alors qu'aucun mutant n'a été décrit jusqu'à maintenant chez les leptospires pathogènes, nous avons obtenu plus d'une centaine de mutants dont une quarantaine pour lesquels nous avons identifié le site d'insertion et donc le gène inactivé. Ce système de transposition est donc applicable aux pathogènes et une analyse plus approfondie de plusieurs de ces mutants est en cours.

Centre National de Référence (CNR) des Leptospires, Centre Collaborateur OMS et FAO pour l'épidémiologie des leptospiroses (G. Baranton, D. Postic, D. Chaumet, D. Deberne, E. Fournié-Amazouz, MA. Golléty, V. Hossard et N. Sertour, avec la collaboration de D. Portnoï)

Voir le site web CNR des Leptospires : http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/lepto-index.html

Si l'année 2004 a été qualifiée d'année très modeste sur le plan de l'endémie leptospirienne, 2005 est la plus faible des deux dernières décennies. Le chiffre de 135 cas pour 5785 demandes selon les données du seul CNR (comparé aux 186 en 2004, 242 en 2003, 244 en 2002 et 241 en 2001 dans les mêmes conditions) est sans équivalent depuis 1985. Au cours de ces vingt-et-une dernières années, le test de micro-agglutination ("Micro Agglutination Test" ou MAT) a été appliqué à tous les sérums adressés.

Le déficit en nombre de cas est présent toute l'année, plus net au second semestre caractérisé par l'absence du pic habituel en septembre. Un contexte assez général de sécheresse en 2004 peut avoir contribué à ce faible niveau de transmission de la leptospirose.

Il est à noter que 2005 sera la dernière année à avoir bénéficié d'un MAT, test sensible et spécifique, systématique pour tous les sérums, assurant une surveillance passive représentative de l'incidence réelle de la maladie. En effet, un changement de la nomenclature des actes de biologie médicale oblige désormais à un criblage préalable par une réaction par macro-agglutination, seuls les sérums positifs ou douteux étant soumis à confirmation par un MAT. Il faut donc s'attendre pour les années à venir à un nombre artefactuellement moindre de leptospiroses, tout particulièrement celles causées par les sérogroupes Grippotyphosa, Australis, Panama … mal détectés par les réactions de dépistage.

Le CNR des Leptospires a publié un bilan de la surveillance épidémiologique de la leptospirose en France métropolitaine de 1920 à 2003 qui montre que des modifications des conditions de diagnostic sont à l'origine d'importantes fluctuations du nombre de cas. Par ailleurs, on observe la présence de pics de recrudescence de un à cinq ans à des rythmes irréguliers.

L'utilisation des VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) pour le typage des sérovars de L. interrogans permettant l'identification des souches en 3 PCRs, publiée en collaboration avec le groupe de M. Picardeau, est en voie d'application au CNR.

Consulter également : http://www.pasteur.fr/recherche/Leptospira/LeptospiraF.html

BORRELIA

Centre National de Référence (CNR) des Borrelia (D. Postic, E. Ferquel, M. Garnier, V. Hossard et N. Sertour, en collaboration avec C. Pérez-Eid et D. Portnoï)

Voir le site web CNR des Borrelia : http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/borrelia-index.html

La borréliose de Lyme, ou maladie de Lyme, est transmise à l'homme par des tiques dures du genre Ixodes et est due à une bactérie Borrelia burgdorferi sensu lato. Caractérisée dans la majorité des cas par un érythème cutané, elle peut se manifester, soit secondairement, soit d'emblée, par des signes neurologiques, articulaires inflammatoires (arthrite), cutanés tardifs ou encore cardiaques.

La difficulté à recueillir des informations cliniques exhaustives explique le peu de données disponibles en France sur l'incidence exacte de la maladie, sa répartition selon les régions et les formes cliniques prédominantes. Avec l'aide de médecins volontaires, un réseau de surveillance a été mis en place dans certaines régions. Ainsi le CNR a réalisé de 2002 à 2005 une étude clinique prospective dans le département de la Meuse. L'incidence de la borréliose de Lyme dans ce département, évaluée à respectivement 79 et 84 cas pour 100 000 habitants en 2002 et 2003, a subi une augmentation significative en 2004 avec 156 cas pour 100 000 habitants.

Une étude similaire a été initiée dans la région Auvergne en 2004. L'incidence de la maladie a été estimée en 2004 à 37 et 58 cas pour 100 000 habitants dans les départements de l'Allier et du Cantal. Le nombre de médecins participant dans la Haute-Loire a été insuffisant pour permettre l'estimation de l'incidence.

Une autre approche de l'épidémiologie de la maladie consiste en l'étude du vecteur I. ricinus, la tique la plus fréquente de nos forêts et prairies, dont la distribution, la densité et le taux d'infection par les différents pathogènes sont une indication du risque pour la population dans une région donnée.

Nous avons ainsi effectué une surveillance des tiques I. ricinus en région Alsace où l'incidence de la borréliose de Lyme avait été estimée lors d'une étude prospective menée par la CIRE-Est de 2001 à 2003. Les cantons de Guebwiller et Munster où l'incidence de la maladie était élevée, de 219 à 279 cas pour 100 000 habitants, et le canton de Dannemarie où l'incidence était faible (36 cas pour 100 000 habitants) ont donc été étudiés durant deux années consécutives en 2003 et 2004. Ce travail nous a permis de mettre en évidence une étroite corrélation entre la densité des tiques infectées par B. burgdorferi sl et l'incidence de la borréliose de Lyme dans trois cantons d'Alsace. A Munster et Guebwiller, le pic de densité des tiques I. ricinus infectées, paramètre directement lié au risque d'infection pour l'homme, est parmi les plus élevés enregistrés en Europe, atteignant 114 tiques infectées par 100 m2. Au contraire, dans le canton de Dannemarie, le maximum de tiques infectées était de 5 par 100 m2.

B. afzelii et B. garinii sont les deux espèces pathogènes identifiées le plus fréquemment dans les tiques en Alsace, la première infectant davantage les nymphes, la seconde les adultes. Vient ensuite l'espèce B. valaisiana. B. burgdorferi ss est plus rarement trouvée dans I. ricinus. B. spielmanii est exceptionnelle et B. lusitaniae n'a jamais été trouvée.

La méthodologie utilisée dans ce travail permettra aisément de comparer les populations de tiques infectées d'une région à l'autre et ainsi d'en déduire le risque de maladie humaine.

Parallèlement le taux d'infection des tiques par les membres de la famille des Anaplasmataceae, transmis par le même vecteur et fréquentant les mêmes biotopes, fait également l'objet d'une surveillance continue. Ainsi un taux d'infection par A. phagocytophilum de 0.37 % chez les nymphes et de 1.2 % chez les tiques adultes a été trouvé en Alsace en 2004. Ehrlichia chaffeensis n'a jamais été retrouvée dans les tiques collectées en Alsace.

Nous avons mis au point une nouvelle méthodologie, le Multi Locus Sequence Analysis, permettant de remplacer la très lourde méthode d'hybridation ADN-ADN pour la définition des espèces de Borrelia. Cette méthode a permis de valider l'espèce B. spielmanii.

Consulter également : http://www.pasteur.fr/recherche/borrelia/Welcomefr.html

Mots-clés: Spirochètes, Leptospira, Borrelia, épidémiologie, génétique, mutagénèse



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  COUEILLE Solange coueille@pasteur.fr SAINT GIRONS Isabelle IP Responsable du laboratoire isgirons@pasteur.fr

BARANTON Guy IP Professeur gbaran@pasteur.fr

PÉREZ-EID Claudine IP Chef de laboratoire cperez@pasteur.fr

PICARDEAU Mathieu IP Chargé de recherche mpicard@pasteur.fr

PORTNOÏ Denis IP Chargé de recherche dportnoi@pasteur.fr

DELÉTAIN Hugues Master 2ème année

FOURNIER Steeve Maîtrise

LOUVEL Hélène Thèse hlouvel@pasteur.fr

MAZOUNI Khalil Post doctorant

RISTOW Paula Thèse (année sandwich) pristow@pasteur.fr

SALAÜN Laurence Post doctorante lsalaun@pasteur.fr

POSTIC Danièle IP Médecin dpostic@pasteur.fr

FERQUEL Elisabeth IP Médecin eferquel@pasteur.fr

BOURHY Pascale Technicienne pbourhy@pasteur.fr

CHAUMET Delphine Technicienne dchaumet@pasteur.fr

DEBERNE Delphine Technicienne ddeberne@pasteur.fr

FAVRE Denise Détachée Centre médical defavre@pasteur.fr

FOURNIÉ Edith Technicienne

GARNIER Martine Technicienne mgarnier@pasteur.fr

GOLLÉTY Marie-Astrid Technicienne

HOSSARD Virginie Technicienne vhossard@pasteur.fr

SERTOUR Natacha Technicienne nsertour@pasteur.fr


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