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     Rétrovirus & Transfert Génétique - INSERM U622


  Responsable : Jean Michel Heard (jmheard@pasteur.fr)


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Thème 1 : Neurodégénérescence associée aux maladies de surcharge lysosomales. Etudes physiopathologiques (inflammation, transport axonal) et thérapeutiques (thérapie génique pour fournir l'enzyme manquante). Thème 2 : Cellules souches neurales. Reprogrammation génétique (expression forcée de facteurs de transcription). Thème 3 : études de l'implication du gène pro-apoptotique Barhl2 au cours du développement, de la tumorigénèse et des processus dégénératifs du système nerveux.



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Thème 1 : Neurodégénérescence associée aux maladies de surcharge lysosomales (J. Ausseil, N. Desmaris, M. Hocquemiller, S. Vitry).

Les maladies de surcharge lysosomale sont des erreurs innées du métabolisme caractérisées par la fréquence des manifestations neurologiques, souvent gravissimes et précoces dans l'enfance. Leurs causes génétiques (en général une perte de fonction) sont bien décrites, ainsi que les conséquences sur les fonctions cataboliques du lysosome. Les mécanismes conduisant du désordre biochimique à la souffrance cellulaire et à la pathologie neurologique sont toutefois incompris et, à ce jour, non accessibles à un traitement. Nos études portent sur deux modèles de mucopolysaccharidoses responsables d'une accumulation d'héparan sulfates incorrectement dégradés et hypersulfatés. Nous essayons de comprendre les liens entre l'accumulation de ces composés, l'activation microgliale et la neurodégénérescence. Les études sont effectuées sur des modèles in vitro et chez des souris génétiquement invalidées pour une ou plusieurs fonctions d'intérêt. Elles portent sur 1) les mécanismes d'activation cellulaire déclenchés par les interactions entre oligosaccharides dérivés des héparan sulfates et divers récepteurs, dont ceux de la réponse immunitaire innée, 2) l'analyse des voies de signalisation perturbées dans divers types cellulaires et 3) les conséquences sur la régulation du trafic intracellulaire, le transport axonal et la myélinisation.

L'apport de l'enzyme lysosomale déficiente dans le cerveau est un traitement possible des manifestations neurologiques des mucopolysaccharidoses à condition de pouvoir franchir ou de contourner la barrière hémato-encéphalique. Nous avons documenté chez la souris et chez le chien l'efficacité et la tolérance de la thérapie génique reposant sur l'injection de vecteurs adéno-associés codant pour l'enzyme manquante directement dans le cerveau. Un essai thérapeutique est en cours de préparation dans les maladies de Sanfilippo et de Hurler. Ce programme est soutenu par l'AFM, l'INSERM et l'Institut Pasteur.

Thème 2 : Cellules souches neurales (S. Blanchard, D. Bohl, S. Liu, A. Nosjean).

La survie, la multiplication, la différenciation, la migration et la maturation des cellules souches neurales dépendent conjointement de signaux externes environnementaux et de la compétence génétique des cellules cibles à y répondre. Certains des déterminants de la différenciation motoneuronale au cours du développement ont été identifiés, comme l'acide rétinoïque (RA) et Sonic Hedgehog (Shh), dont les concentrations déterminent l'expression de facteurs de transcription spécifiques possédant un domaine homéotique ou bHLH.

Nous examinons le devenir de cellules souches neurales fœtales ou adultes amplifiées sous forme de neurosphères dans lesquelles on force l'expression de facteurs de transcription impliqués dans la différenciation des motoneurones au cours du développement embryonnaire (Pax6, Nkx6.1, Olig2, Ngn2, HB9) grâce au transfert de gène à l'aide de vecteurs lentiviraux. L'expression de multiples marqueurs associés à la différenciation motoneuronale est étudiée par PCR quantitative et immuno-marquage. L'expression forcée d'HB9 modifie la différenciation neuronale, mais elle n'est pas suffisante pour induire des motoneurones in vitro ou après transplantation dans la moelle épinière chez le rat. L'expression conjointe de Ngn2 et HB9 induit l'expression d'autres facteurs impliqués dans la différenciation motoneuronale et confère aux cellules la capacité de former des motoneurones en réponse aux facteurs Shh et RA. L'expression simultanée de Nkx6.1 amplifie le phénomène.

Nous étudions également le devenir des cellules souches neurales fœtales transplantées dans le noyau moteur du nerf facial chez la souris afin de mettre en évidence une croissance axonale. Un nerf périphérique pré-dégénéré est inséré directement dans le noyau moteur dans ce but. Nous avons montré que la transplantation dans cet environnement influence la différenciation des cellules souches. Au bout de 2 mois, il y a plus de cellules implantées exprimant un phénotype cholinergique à ce site que lorsque la transplantation est effectuée dans le striatum, et plus en présence du greffon qu'en son absence. Ces cellules émettent des prolongements cholinergiques dans le greffon nerveux.

Thème 3 : Études de l'implication du gène pro-apoptotique Barhl2 au cours du développement précoce du cerveau et de la tumorigénèse (B. Durand, N. Duval).

L'apoptose est une forme morphologiquement caractéristique d'auto-destruction de la cellule. L'étude des souris mutantes pour les molécules effectrices de l'apoptose a révélé l'importance d'une apoptose dite précoce (AP), qui touche des cellules en phase proliférative, et plus particulièrement les précurseurs du système nerveux central (CNS). La survie des cellules des vertébrés est sous le contrôle permanent de facteurs extracellulaires qui inhibent le programme apoptotique en particulier Sonic HedgeHog (SHH). Notre équipe a mis en évidence qu'un gène à homéoboîte très fortement conservé chez les métazoaires, barhl2, est un régulateur transcriptionnel de la survie des précurseurs neuraux. Nos résultats suggèrent que barhl2 fait partie de la voie de survie contrôlée par Shh. Des mutations dans des gènes de la voie HH ont été décrites dans 25% des médulloblastomes sporadiques humains. Ces tumeurs proviennent de la prolifération erratique des précurseurs des cellules granulaires du cervelet localisées dans la couche granulaire externe (EGL). Barhl2 et barhl1 son homologue le plus proche sont co-exprimés dans les cellules granulaires précurseurs du cervelet et la destruction spécifique du locus codant pour barhl1 démontre que ce gène joue un rôle essentiel dans la survie des cellules de l'EGL.

Nos efforts de recherche se sont portés sur 1) Élucider la ou les relation(s) épistatique(s) entre barhl2 et Gli3 un des effecteurs moléculaires de l'apoptose contrôlée par Shh par une approche puces à ADN ; 2) Faire le lien entre ces facteurs de transcription et la machinerie apoptotique au cours du développement précoce de la plaque neurale chez le Xénope et dans les cellules granulaires précurseurs du cervelet ; 3) Clarifier le rôle de barhl2, et conséquemment de l'AP, lors de la mise en place du diencéphale un région charnière mal connue du cerveau antérieur.

Ce travail nous permettra d'obtenir des informations quant aux réseaux transcriptionnels régulant la survie cellulaire des précurseurs neuraux, processus qui joue un rôle spécifique et non déterminé lors de la morphogenèse du système nerveux central et qui est dérégulé lors de l'émergence de cancer.

Légende de la photo : Différenciation motoneuronale in vitro de cellules souches neuronales traitées par trois vecteurs lentiviraux induisant respectivement l'expression des facteurs HB9, Ngn2 et Nkx6.1. L'activité cholinestérasique est révélée par la méthode de Karnosky.

Mots-clés: thérapie génique, neurodégénérescence, maladies lysosomales, cellules souches neurales, vecteurs viraux, développement du système nerveux, sonic hedgehog, Barh, gènes homéotiques



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Chantal Brulet, Delphine Bohl CR1 INSERM dbohl@pasteur.fr

Béatrice Durand CR1 CNRS bdurand@pasteur.fr

Jean Michel Heard DR1 INSERM jmheard@pasteur.fr

Song Liu CR1 INSERM songliu@pasteur.fr

Anne Nosjean CR1 CNRS nosjean@pasteur.fr

Nathalie Duval CR IP natoche@pasteur.fr

Jérôme Ausseil Stage post-doctoral ausseil@pasteur.fr

Sandrine Vitry Stage post-doctoral svitry@pasteur.fr

Michael Hocquemiller Etudiant en thèse Paris V michoc@pasteur.fr

Nathalie Desmaris Technicienne Supérieure 2D nchodan@pasteur.fr

Stéphane Blanchard Technicien Supérieur 2D sblancha@pasteur.fr


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