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     Production de Protéines recombinantes et d'anticorps (Plate-forme)


  Responsable : BÉGUIN Pierre (beguin@pasteur.fr)


  resume

 

La Plate-forme Production de Protéines Recombinantes et d'Anticorps a pour mission la production et la purification de protéines recombinantes ainsi que la production d'anticorps monoclonaux. Elle participe au programme de génomique structurale des Mycobactéries pathogènes et au Grand Programme Horizontal sur la tuberculose. Elle produit et caractérise des anticorps monoclonaux pour la recherche, le diagnostic et la thérapeutique



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La Plate-forme n° 5 comporte trois modules : a) Production d'anticorps monoclonaux (resp. Farida Nato, fnato@pasteur.fr); b) Production de protéines recombinantes (responsable Jacques Bellalou, bellalou@pasteur.fr); c) Purification de protéines et production de protéines dans le système baculovirus (resp. Stéphane Pêtres, spetres@pasteur.fr).

Anticorps Monoclonaux

Ce module est chargé de développer la production d'anticorps monoclonaux et leur caractérisation fine (détermination de constante d'affinité, "mapping" d'épitopes etc) en collaboration avec différentes unités de l'Institut. Les anticorps sont utilisés comme outils de recherche et de diagnostic ainsi que pour le développement de nouvelles thérapies.

Dans le domaine de la recherche, plusieurs projets concernent la détection d'antigènes présents à la surface des mérozoites de Plasmodium falciparum ou à la surface de globules rouges infectés par le parasite. Des anticorps monoclonaux contre ces antigènes serviront à tester in vitro leur pouvoir inhibiteur contre l'infection et à valider le choix des antigènes correspondants comme candidats vaccins. D'autres projets concernent la mise au point d'un dosage immunologique de la sialorphine, un inhibiteur peptidique de l'enképhalinase modulant la transmission des signaux nociceptifs, et la production d'anticorps reconnaissant la protéine NEMO, un médiateur important de la voie NF-κB. Par ailleurs, nous essayons également de produire des anticorps monoclonaux qui reconnaîtraient spécifiquement les branchementsβ1,3/1,6-glucanes de la paroi fongique.

Dans le domaine du diagnostic, le module s'est spécialisé dans la mise au point de tests immunochromatographiques sur bandelettes. Ces tests permettent l'identification dans les fluides biologiques d'antigènes spécifiques d'un pathogène. Ils sont très rapides, fiables et peuvent être exécutés dans les conditions les plus rustiques. Nos projets actuels visent à développer des tests pour la peste, les méningites et les diarrhées hémorragiques. Des bandelettes de détection sont en cours d'évaluation sur le terrain pour la peste, les méningites dues aux sérovars de Neisseria meningitidis A, C, Y et W135 et pour les dysentries dues à Shigella dysenteriae et à Shigelle flexneri. D'autres tests sont en cours de mise au point pour le diagnostic du pneumocoque, d'Haemophilus influenzae type B, d'Entamoeba histolytica et des Escherichia coli entérohémorrragiques.

Dans le domaine de la thérapie, le projet en cours consiste à obtenir des anticorps neutralisant les toxines du botulisme. L'immunothérapie est en effet le seul remède connu à l'heure actuelle contre cette pathologie.

Production de Protéines Recombinantes

Le module de Production de Protéines Recombinantes assure la production de cultures bactériennes en fermenteurs de 1 à 300 litres et la préparation d'extraits bruts des culots de cellules qui en dérivent. Il offre à la demande une activité d'expertise pour optimiser la production de protéines recombinantes. Depuis cette année, le module s'investit également dans la purification des protéines grâce à l'acquisition par la Plate-forme d'un second chromatographe Äkta.

L'objectif commun de ces activités est de produire chez Escherichia coli des quantités élevées de protéines recombinantes sous forme soluble et correctement repliée. Ces protéines, au besoin marquées à la sélénométhionine, sont utilisées afin de déterminer leur structure par cristallographie aux rayons X ou par RMN ou d'étudier leur fonction. Afin d'optimiser rapidement les paramètres de croissance et permettre une production à haut débit, nous utilisons une batterie constituée de 8 réacteurs miniaturisés, pilotés par un système informatique qui contrôle les principaux paramètres de chaque culture dans des conditions définies et totalement indépendantes. En fonction de l'évolution de la densité bactérienne mesurée en ligne, des séquences de température de croissance avant et après induction peuvent être programmées et réalisées automatiquement. Cette technologie est donc tout à fait adaptée à l'optimisation et à la production de protéines peu solubles. Grâce à l'utilisation de milieu Haute Densité, les rendements en biomasse totale et en protéine recombinante obtenus dans chaque réacteur de 70 ml sont similaires à ceux obtenus pour un litre de culture en fiole agitée. De plus, les conditions ainsi établies peuvent être directement transposées à des cultures en fermenteurs classiques de volume plus élevé.

En plus de nombreuses demandes ponctuelles d'optimisation et de production de protéines recombinantes, le module participe à un programme de génomique structurale de Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae ainsi qu'à un Grand Programme Horizontal sur la tuberculose. Notre rôle dans ce programme consiste à produire des protéines cibles pouvant servir au diagnostic, à la vaccination ou au criblage de nouveaux agents thérapeutiques. Par ailleurs, nous utilisons la batterie de microfermenteurs pour mettre au point les conditions de culture d'autres microorganismes qu'E. coli. Ainsi, dans le cadre du projet de génomique structurale de M. tuberculosis, certaines protéines sont produites chez Mycobacterium smegmatis car cet hôte permet un meilleur rendement en protéine native et soluble qu'E. coli. Nous participons en outre à un programme transversal de recherche visant à développer un milieu de culture permettant d'accélérer la croissance de Legionella pneumophila afin de diagnostiquer plus rapidement cette bactérie. En plus des cultures en batterie de microfermenteurs, ce projet comporte l'analyse du milieu par HPLC afin de suivre la consommation de substrat et la production de métabolites.

Purification et Production de Protéines dans le Système Baculovirus.

Ce module prend en charge la production de protéines codées par des baculovirus recombinants infectant des cellules d'insectes. Ce système est en effet mieux adapté qu'E. coli à la production de protéines d'origine animale, tant pour ce qui est du repliement que des modifications post-traductionnelles (glycosylation). Depuis l'année dernière, le module pratique également la production dans des cellules de drosophile, particulièrement pour les protéines virales. Par ailleurs, il continue d'assumer une grande partie des tâches de purification de protéines, tant à partir de culots de bactéries qu'à partir de cultures de cellules d'insectes.

Outre les demandes ponctuelles, le module collabore à plusieurs projets à moyen et à long terme. Dans le domaine de la parasitologie, il participe aux efforts visant à produire les subtilisines PvSub1 et PvSub2 de Plasmodium vivax, qui sont indispensables au cycle de propagation du parasite et représentent des cibles thérapeutiques et vaccinales prometteuses. Il est également impliqué dans la production de domaines de l'adhésine varO de Plasmodium falciparum. Dans le domaine de la thérapie du cancer, il a été chargé de produire des transglycosylases d'origine tumorale servant à la synthèse in vitro de dérivés glycosylés de la mucine qui seront évalués comme vaccins anti-tumoraux. En ce qui concerne la virologie, il est impliqué dans la production de protéines du virus de la dengue en vue de leur caractérisation structurale. Pour terminer, il participe à un projet visant à élucider les mécanismes d'adaptation de l'oreille interne à l'intensité du son en produisant les protéines impliquées dans le processus, telles que la myosine 1c ou la protéine PhretB, qui serviront soit à produire des anticorps monoclonaux, soit à identifier par co-immunoprécipitation les partenaires avec lesquels elles interagissent.

Photo : Batterie de fermenteurs en parallèle pour les cultures bactériennes à haut débit. A gauche, unité de réacteurs; à droite, unité de contrôle.

Mots-clés: Fermenteurs, protéines recombinantes, cultures automatisées, purification de protéines, baculovirus, anticorps monoclonaux, génomique structurale



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  ESNARD Muriel (mesnard@pasteur.fr) BÉGUIN Pierre, Institut Pasteur (Chef de Laboratoire, beguin@pasteur.fr) JAUNASSE Lydie, DESS en Génie Cellulaire, U. Henri Poincaré, Nancy 1

MAHAMANE, Ali Elhadji, Ingénieur biologiste, CERMES, Niger

MARIMOUTIN Karine, Licence Professionnelle de Biologie Appliquée, U. Paris-Sud 11

BELLALOU Jacques, Ingénieur 3 Institut Pasteur, (bellalou@pasteur.fr)

BONDET Vincent, Ingénieur 2 Institut Pasteur, (vbondet@pasteur.fr)

DARTEVELLE Sylvie, Technicienne Supérieure 2D Institut Pasteur, (sdarteve@pasteur.fr)

ESNARD Muriel Secrétaire 2D Institut Pasteur(mesnard@pasteur.fr)

FOURNIE-AMAZOUZ Edith, Technicienne Supérieure 2D Institut Pasteur, (serpu@pasteur.fr)

FRACHON Emmanuel Ingénieur 2 Institut Pasteur, (efrachon@pasteur.fr)

LAURET Marie-Reine, Aide de Laboratoire Institut Pasteur (mrlauret@pasteur.fr)

MARCHAND Françoise, Technicienne Supérieure de Laboratoire 1D Institut Pasteur (fmarch@pasteur.fr)

NATO Farida, Ingénieur 4 Institut Pasteur, (fnato@pasteur.fr)

NOWAKOWSKI Mireille, Technicienne Supérieure de Laboratoire 1D Institut Pasteur (mnowak@pasteur.fr)

PETRES Stéphane, Technicien Supérieur 2D Institut Pasteur, (spetres@pasteur.fr)


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