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     Protéomique (Plate-forme)


  Responsable : Namane Abdelkader (anamane@pasteur.fr)


  resume

 

L'objectif principal de la Plate-Forme de Protéomique est la mise en place de technologies performantes pour l'identification et la caractérisation des protéines, en associant des méthodes de séparation telles que l'électrophorèse bidimensionnelle ou la chromatographie liquide à la spectrométrie de masse. Notre activité scientifique, issue de nombreuses collaborations, est associée à une activité de service



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La Plate-Forme de Protéomique (PF3), composante de Pasteur-Génopole® Ile-de-France, fait partie du Département de Biologie Structurale et Chimie. Son objectif est de mettre à la disposition du campus, une technologie performante en électrophorèse bidimensionnelle et en spectrométrie de masse.

L'électrophorèse bidimensionnelle reste actuellement la technique de séparation des protéines solubles la plus résolutive et permet d'établir une cartographie du protéome. Des améliorations notables ont été apportées au cours de l'année dans les protocoles de préparation des échantillons (tampons d'extraction, procédés d'enrichissement, kits de nettoyage..), et de nouveaux programmes de focalisation ont été standardisés. Les mises en place du fractionnement des protéines utilisant le Zoom Fractionator (Invitrogen) avant séparation par électrophorèse et de la coloration des protéines par des agents fluorescents (Sypro Ruby et ProQ Diamond) ont été réalisées.

Nous disposons de trois spectromètres de masse, qui dans l'ordre d'installation sont un electrospray triple quadripôles (API 365, ABI-MDS-SCIEX), un instrument de type maldi temps de vol, Maldi-Tof, (Voyager DE-STR, ABI-PerSeptive Biosystems), et un instrument de type hybride " quadripôle-temps de vol " (QSTAR XL, ABI-MDS-SCIEX). Les deux premiers instruments nous ont permis d'une part d'aborder la caractérisation de biomolécules et d'autre part l'identification des protéines dans les banques de données, par carte peptidique massique, à partir de leur digestion par la trypsine dans les gels d'électrophorèse et la caractérisation des biomolécules. L'instrument hybride, QSTAR XL nous a permis d'accéder à l'approche protéomique utilisant la chromatographie liquide mono ou multidimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse (MDLC-MSMS) ou " shotgun proteomics ").

Trois types d'approches protéomiques mettant en jeu toutes les technologies disponibles sur la plate-forme ont été réalisés au cours de l'année 2005. L'approche protéomique globale permet de réaliser un inventaire du contenu protéique. Par exemple, l'étude du protéome de Mycobacterium ulcerans se fait en plusieurs étapes constituées par l'identification des protéines solubles, des protéines membranaires et des protéines exportées. Cette approche utilise les gels 2D associés au Maldi-tof pour l'identification des protéines par la carte peptidique massique et une approche MDLC-MSMS (Gilles Reysset, Génétique moléculaire bactérienne). Une approche protéomique comparative permet la visualisation et l'identification des variations d'expression dans le protéome d'une espèce. Nous avons étudié la variation de l'expression des protéines des glandes salivaires provenant de moustiques infectés ou non par Plasmodium falciparum, en utilisant d'une part l'électrophorèse bidimensionnelle comparative et d'autre part l'approche iTRAQ (Applied Biosystems) couplée à la LC-MSMS (V Choumet, GPH Anophèles).

L'approche protéomique " ciblée " implique l'enrichissement préalable des protéines d'intérêt par diverses méthodologies. . Cette approche a été largement utilisée pour différents sujets soumis à la plate-forme. Ainsi, une étude du phosphoprotéome de Candida albicans a été initiée en électrophorèse et sera développé en 2006 (S Goyard, Biologie et Pathogénécité fongiques). Nous avons continué l'étude structurale de fragments de peptidoglycane de pathogènes humains tels que Helicobacter pylori et  Listeria monocytogenes. (Ivo BONECA, Pathogénie Bactérienne des Muqueuses). Nous avons aussi identifié les protéines obtenues par immunoprécipitation provenant de sujets atteints de neuropaludisme (S Pied, Immunophysiopathologie Infectieuse). Dans un autre programme chez la levure, l'utilisation de mutations conditionnelles, suivie de purifications sélectives des complexes protéiques bloqués à des étapes précises, par l'approche TAP (Tandem Affinity Purification) nous a permis de continuer l'identification des partenaires constituants ces complexes protéiques, nécessaires à la maturation des ARN ribosomaux et leur ordre d'assemblage. Ce projet se poursuit actuellement avec des approches quantitatives utilisant des isotopes stables : le SILAC et l'iTRAQ. Cette approche quantitative donne des résultats très encourageants dans la détermination de l'ordre d'assemblage des partenaires (A. Jacquier, Génétique des Interactions Macromoléculaires). Enfin, une approche d'identification des partenaires protéiques par la méthode du TAP est aussi appliquée à des protéines de Helicobacter pylori (H de Reuse, Pathogénie Microbienne des Muqueuses)

Parallèlement à ces contributions, la Plate-Forme de Protéomique a également une activité de service.

Mots-clés: protéomique, électrophorèse, spectrométrie de masse, LC-MSMS, protéines



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Saint-Martin, Françoise, martinf@pasteur.fr   Tafelmeyer, Petra, Post-doc , petra@pasteur.fr Laurent, Christine, Ingénieur, chris@pasteur.fr

Lenormand, Pascal, Technicien Supérieur, plenorma@pasteur.fr

Montalent, Pierre, Ingénieur,

Namane, Abdelkader, Ingénieur, anamane@pasteur.fr

Rousselle, Jean-Claude, Ingénieur, jroussel@pasteur.fr


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