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     Cyanobactéries - CNRS URA 2172


  Responsable : TANDEAU de MARSAC Nicole (ntmarsac@pasteur.fr)


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Les cyanobactéries, procaryotes oxyphototrophes, jouent un rôle important dans le maintien de l'équilibre entre le CO2 et l'oxygène dans l'atmosphère. Adaptées à des environnements variés, même extrêmes, elles colonisent la plupart des écosystèmes aquatiques et terrestres. Au cours des dernières décennies, les efflorescences de cyanobactéries planctoniques se sont multipliées dans les écosystèmes aquatiques continentaux, conséquence des pollutions introduites par l'Homme. Outre les dysfonctionnements environnementaux qu'elles engendrent, ces proliférations peuvent être dangereuses pour la santé animale et humaine, en raison du grand nombre de métabolites secondaires (hépato- et/ou neurotoxines) que certaines cyanobactéries produisent.

Nos travaux de recherche visent à accroître notre connaissance de la biodiversité et de la physiologie des cyanobactéries, en particulier des souches toxiques. Ces études, du gène à l'écosystème, sont abordées par des approches multidisciplinaires qui s'appuient sur des échantillons collectés dans l'environnement et sur une collection de souches axéniques, la PCC, développée depuis de nombreuses années dans notre laboratoire.



  rapport

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1. La PCC ou "Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria"

La PCC est internationalement reconnue tant pour la qualité (cultures axéniques) que pour la diversité des propriétés morphologiques et physiologiques de ses souches.

Les missions de la PCC comprennent à la fois des activités de service et de recherche :

Préservation et accroissement des ressources biologiques (R. Rippka, I. Iteman, M. Herdman, T. Coursin et T. Laurent)

La PCC comprend environ 750 souches axéniques représentatives d'une soixantaine de morphotypes provenant d'écosystèmes très divers ; 475 souches sont disponibles sur catalogue (http://www.pasteur.fr/recherche/banques/PCC/). Dans l'optique d'une intégration de la PCC dans le Centre de Ressources Biologiques de l'Institut Pasteur (CRBIP), la mise en place du contrôle qualité est en cours. Un grand nombre de cyanobactéries planctoniques sont sensibles à la conservation en azote liquide, même en présence d'un cryoprotecteur, le diméthylsulfoximide. Nous avons montré que l'ajout de desferrioxamine, un chélateur de fer ayant indirectement un effet antioxydant, améliore la survie de deux souches du genre Arthrospira ("Spiruline"). Ce chélateur est actuellement testé sur d'autres souches pour en élargir l'utilisation si possible.

Distribution et ventes de souches (R. Rippka)

En 2005, environ 300 souches ont été envoyées à des laboratoires de recherche et des industriels dans le monde entier, ainsi que pour l'enseignement en France et au Sénégal. Une importante activité de conseil est également associée à la PCC.

Bases de données (I. Iteman, R. Rippka et M. Herdman)

"CYANOBANK" (Windows 98, Microsoft Access) : propriétés des souches de la PCC ; "ITS size database" : nombre et taille des amplicons des ITS (300 entrées) ; "Photographic database" (610 entrées) ; "Storage database" : inventaire des souches conservées dans l'azote liquide ; les trois derniers modules interagissent avec CYANOBANK. D'autres bases de données sont indépendantes de CYANOBANK : "ITS sequence database" avec ~300 séquences d'ITS de cyanobactéries alignées ; "Cyanobacterial 16S rRNA sequence database", maintenue sous le logiciel ARB avec plus de 900 séquences alignées ; "Bacterial 16S rRNA sequence database", qui permet de choisir des amorces oligonucléotidiques ou des sondes et comprend plus de 13000 séquences ; bases de données (sous GelCompare) des profils RFLP des ITS et des profils obtenus par amplification avec des amorces basées sur les séquences HIP1 ; banque photographique (~700 entrées) basée sur l'observation d'échantillons naturels. La majorité des données concernant les propriétés des souches de la PCC ont été transférées de "CYANOBANK" dans une nouvelle base de données commune aux collections du CRBIP et une nouvelle édition du catalogue de la PCC est parue en 2005.

Recherche et caractérisation de métabolites secondaires, toxiques ou bioactifs

Alcaloïdes neurotoxiques (A. Méjean, C. Peyraud-Thomas et R. Rippka). Les cyanobactéries synthétisent différents types d'alcaloïdes neurotoxiques mortels pour les animaux et dangereux pour l'Homme. Afin de pouvoir quantifier l'anatoxine-a dans les souches de cyanobactéries neurotoxiques et dans des échantillons prélevés dans l'environnement, nous avons synthétisé in vivo de l'anatoxine-a marquée par les isotopes 13C et au 15N à partir de la souche Oscillatoria PCC 6506. Des campagnes d'échantillonnage ont été effectuées en été dans le sud de la France sur des sites où des mortalités de chiens avaient été répertoriées chaque année depuis 2002. La présence d'anatoxine-a dans la majorité des échantillons a été détectée par chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Plusieurs cyanobactéries filamenteuses non-hétérocystées ont été isolées de ces échantillons, dont deux appartenant aux genres Geitlerinema et Oscillatoria Ces souches ont été rendues axéniques, afin de pouvoir déterminer leur toxicité.

Oligopeptides toxiques ou bioactifs (S. Cadel, M. Welker, V. Gaget, I. Iteman, A.M. Castets et N. Tandeau de Marsac). Les cyanobactéries du genre Microcystis synthétisent par voie non ribosomale des oligopeptides hépatotoxiques (microcystines) et des inhibiteurs de protéases à sérine (cyanopeptoline et aéruginosine). La cyanopeptoline a en outre une activité cytotoxique et promotrice de la différenciation cellulaire. Dans le cadre du projet européen PEPCY "Toxic and bioactive peptides in cyanobacteria"  (http://www.pepcy.de/) et en collaboration avec le groupe de E. Dittmann (Humboldt Universität, Berlin, Allemagne), nous avons caractérisé les peptides synthétases et les polykétides synthases impliqués dans la synthèse de ces oligopeptides et des mutants ont été construits en vue de comprendre le rôle de ces oligopeptides. Selon les souches, la cyanopeptoline et l'aéruginosine sont chlorées ou non-chlorées et, chez une même souche, la chloration de l'un de ces deux oligopeptides est exclusive. Au niveau génomique, les gènes codant les halogénases sont flanqués de séquences répétées directes et inversées caractéristiques des éléments d'ADN mobiles, et une empreinte génomique demeure en place lorsque ces gènes sont absents. Au sein des halogénases bactériennes, les enzymes cyanobactériennes forment un groupe monophylétique pouvant suggérer une acquisition unique et ancienne au cours de l'évolution (Collaboration avec C. Dauga, Plate-forme 4 - Intégration et Analyse génomique). De plus, la division de ce groupe en 2 sous-groupes révèle la haute spécificité de ces enzymes pour leur substrat : le 4-hydroxyphenyl lactate pour l'halogénase des aéruginosines et la tyrosine pour celle des cyanopeptolines. Ces enzymes sont FADH2-dependantes et appartiennent à la famille des halogénases qui chlorent les phénols et les dérivés pyrroles. La caractérisation biochimique de ces halogénases et la détermination de leur rôle chez Microcystis font l'objet de recherches en cours. Enfin, dans le cadre d'un projet de Recherche et Développement (Contrat tripartite Veolia-Eau/Genesystems/Institut Pasteur), nous mettons au point un système de détection et d'identification rapide et fiable de trois genres cyanobactériens potentiellement hépatotoxiques (Microcystis, Anabaena et Planktothrix) dans l'environnement, afin de prévenir un risque sanitaire au niveau des réserves d'eau destinées à la consommation humaine.

2. Biodiversité et écologie des communautés microbiennes aquatiques (J.F. Humbert)

Contrôle des populations de Planktothrix rubescens dans le lac du Bourget : Nous avons montré par une approche comparée, que les souches de Planktothrix pigmentées en rouge proliférant dans le lac du Bourget sont tout à fait bien adaptées à la niche écologique qu'elles occupent. En effet, cet écotype s'est révélé particulièrement compétitif à des températures peu élevées et dans des conditions d'éclairement faible et dominé par les longueurs d'onde verte. D'autre part, il est apparu que ces cyanobactéries étaient peu consommées par le zooplancton et donc que la prédation ne semblait pas exercer un contrôle direct sur la dynamique de ses populations (Collaboration avec Pr. B. Pinel-Alloul, Université du Québec, Montréal, Canada).

Composition et structure des communautés bactériennes dans les écosystèmes aquatiques continentaux : L'influence relative du niveau trophique des plans d'eau, de leurs caractéristiques volumétriques et d'autres paramètres tels que le climat sur la composition et la structure des communautés eubactériennes des écosystèmes aquatiques continentaux a été déterminée. Pour cela, nous avons procédé à la constitution de plusieurs banques de clones après amplification par PCR d'un fragment d'ADNr 16S sur des ADN provenant d'échantillons d'eau prélevés dans des lacs alpins et des réservoirs africains. Le séquençage de ce fragment dans près de 1000 clones issus de ces banques a fourni des résultats originaux sur la structure de ces communautés. Ainsi, il apparaît que toutes ces communautés sont dominées par les actinobactéries et que les écosystèmes de petites tailles peuvent subir de fortes divergences dans leur composition bactérienne (effets de dérives ?). En revanche dans les grands lacs alpins, malgré des statuts trophiques contrastés, aucune différence significative n'est apparue dans la structure de ces communautés (Collaboration avec P. Cecchi et M. Bouvy, IRD, France))).

3. Structure des génomes et potentiels adaptatifs chez les cyanobactéries (P. Quillardet, A.M. Castets, D. Mourier des Gayets et N. Tandeau de Marsac)

Les cyanobactéries planctoniques du genre Microcystis forment des efflorescences très nuisibles pour l'Homme et les animaux. Afin de comprendre le cycle de développement de ces organismes et leurs capacités d'adaptation aux variations de paramètres environnementaux, nous avons choisi comme modèle d'étude la souche hépatotoxique Microcystis aeruginosa PCC 7806. Le séquençage de son génome est en cours de finition en collaboration avec l'équipe de C. Bouchier (Plate-forme 1 - Génomique), et avec L. Frangeul et S. Bun (Plate-forme 4 - Intégration et Analyse génomique). L'analyse génomique a d'ores et déjà révélé l'existence de plusieurs gènes codant des protéines permettant de mieux comprendre le mode de vie de Microcystis et notamment ses capacités à proliférer. Il s'agit tout d'abord d'une lectine, la microvirine qui se lie spécifiquement à des sucres de type mannane. Les lectines sont les cibles de signaux intercellulaires chez les bactéries qui forment des biofilms. Par analogie, les interactions entre microcystines, lectines et lipopolysaccharides chez les souches de Mircocystis pourraient assurer la formation et/ou le maintien des colonies dont l'état d'agrégation contribue de façon très significative au succès de ces cyanobactéries dans leur environnement (Collaboration avec l'équipe de E. Dittmann, Humboldt Universität, Berlin, Allemagne). La seconde protéine (RbcLIV) appartient à la forme IV de la superfamille des ribulose-1,5-bisphosphates carboxylases/oxygénases (RuBisCO). Cette protéine présente une faible similarité avec la grande sous-unité (RbcLI) de l'enzyme qui catalyse la fixation du dioxyde de carbone. Chez Microcystis, l'expression du gène rbcLIV augmente en carence en soufre, ce qui suggère que RbcLIV joue un rôle dans le métabolisme du soufre. Cette enzyme a une activité énolase, mais n'a pas d'activité carboxylase ; elle n'effectue donc que la première des trois réactions chimiques catalysées par la RuBisCO de forme I. Enfin, la complémentation d'un mutant MtnW de Bacillus subtilis, a montré que RbcLIV pourrait être impliqué dans le recyclage de la méthionine (Collaboration avec l'équipe de A. Yokota, Nara Institute of Science and Technology, Japon). Cette capacité métabolique inconnue jusqu'alors chez les cyanobactéries représente vraisemblablement un avantage adaptatif pour Microcystis dans des périodes de son cycle où elle forme des efflorescences denses, les cellules en surface étant alors exposées à un fort éclairement et à des concentrations élevées en oxygène. Microcystis est le premier microorganisme chez lequel il est démontré qu'une RuBisCO de forme I, intervenant dans la photosynthèse, coexiste avec une RuBisCO de form IV.

Les cyanobactéries des genres Prochlorococcus et Synechococcus sont ubiquistes et dominantes dans le phytoplancton marin. Elles contribuent de façon majeure à la production primaire photosynthétique sur notre planète. Dans les régions centrales des océans pauvres en nutriments, les Prochlorococcus sont plus abondants que les Synechococcus. Inversement, ces derniers sont prépondérants dans les zones plus riches en nutriments et dans les régions côtières. En 2005, le séquençage du génome de Synechococcus RCC307 (http://www.cns.fr/externe/Francais/Projets/Projet_HP/organisme_HP.html, souche isolée d'une zone oligotrophe, a été réalisé au Génoscope d'Evry (France) en collaboration avec un consortium international de cinq laboratoires (dont notre Unité) coordonné par F. Partensky (Station Biologique de Roscoff, France). Le génome de la souche WH7803 séquencé par le même consortium en 2004 a été annoté. L'analyse comparative des dix génomes de Synechoccoccus marins (provenant de zones de remontées d'eaux profondes et de zones océaniques centrales ou côtières) et de trois souches de Prochlorococcus (adaptées à des fortes ou faibles intensités lumineuses) a permis de mettre à jour la diversité de structure de leur génome (différents degrés de compacité et de plasticité), ainsi que leurs caractéristiques évolutives selon les niches écologiques qu'elles occupent.

Légendes des photos : Anabaena sp. (gauche), Microcystis sp. (centre), Planktothrix sp. (droite).

Mots-clés: Collection de cyanobactéries (PCC), Bases de données, Biodiversité, Toxines, Métabolisme, Génome



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  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  LENOIR Lucile (llenoir@pasteur.fr) HERDMAN Michael, CNRS (Chargé de Recherche 1, mherdman@pasteur.fr)

HERDMAN-RIPPKA Rosmarie, IP (Chargé de Recherche, rrippka@pasteur.fr)

HUMBERT Jean-François, INRA (Directeur de Recherche, humbert@pasteur.fr)

ITEMAN Isabelle, IP (Chargé de Recherche, iiteman@pasteur.fr)

MEJEAN Annick, UP7 (Maître de Conférences, amejean@pasteur.fr)

QUILLARDET Philippe, IP (Chargé de Recherche, philqui@pasteur.fr)

TANDEAU de MARSAC, CNRS (Directeur de Recherche 1) IP (Chef de Laboratoire, ntmarsac@pasteur.fr)

BUN Somaly, IP (Contrat d’apprentissage en BioInformatique)

CADEL SIX Sabrina, UP6 (Doctorante)

GAGET Virginie, UP7 (Doctorante)

KEHR Jan-Christoph (Etudiant)

MOURIER des GAYETS Daphné (Etudiante)

PEYRAUD-THOMAS Caroline (Chercheur post-doctoral)

TOLONEN Andrew (Chercheur post-doctoral)

CASTETS Anne-Marie, CNRS (Assitante-Ingénieur, acastets@pasteur.fr)

COURSIN Thérèse, IP (Technicienne Supérieure de Laboratoire, tcoursin@pasteur.fr)

LAURENT Thierry, IP (Technicien de Laboratoire, tlaurent@pasteur.fr)


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