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     Plasticité du génome bactérien


  Responsable : MAZEL Didier (mazel@pasteur.fr)


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Nous nous intéressons à la variabilité dans l'organisation des génomes bactérien, en particulier aux mécanismes d'acquisitions d'ADN d'origine exogène-les transferts latéraux de gènes. Nous étudions principalement le système de génie génétique naturel que constituent les intégrons, et qui joue un rôle majeur dans le développement et la dissémination des résistances multiples aux antibiotiques. De façon plus générale, nous nous intéressons à la structure des génomes des bactéries du genre Vibrio, qui ont pour caractéristique commune d'être constitués de deux chromosomes circulaires.



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A- Les intégrons.

Les transferts horizontaux de gènes jouent un rôle essentiel pour l'évolution des bactéries. Ces phénomènes jouent un rôle incontestable dans la propagation des déterminants de virulence et de pathogénicité, mais c'est toutefois dans l'émergence et le développement des multi-résistances au cours de la dernière moitié de ce siècle, que l'on trouve l'illustration la plus frappante, et peut-être la plus préoccupante, de l'importance de ces échanges génétiques. Dans ce phénomène global, la contribution d'une classe particulière d'élément mobiles, les intégrons, a été primordiale pour l'acquisition et la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram négatif. C'est l'étude de ces mécanismes de transfert génétique, plus particulièrement ceux qui impliquent les intégrons, que nous poursuivons afin de mieux comprendre la dynamique et la mécanique de ces échanges génétiques, et leur rôle général dans la plasticité et l'évolution des génomes bactériens.

La structure de base des intégrons est invariablement composée d'un gène spécifiant une recombinase spécifique de site du type intégrase l et d'un site de recombinaison, attI, situé en amont de celui-ci. L'activité de l'intégrase permet l'insertion ou le remplacement de cassettes portant un gène de résistance, au niveau du site attI, aboutissant à l'assemblage de loci multi-géniques pouvant héberger jusqu'à huit cassettes consécutives. À cette date, plus de quatre-vingt-cinq cassettes de résistance différentes ont été décrites, qui partagent toutes la même structure modulaire: elles sont toujours composées d'un seul gène et se terminent par une séquence indispensable à la reconnaissance par l'intégrase et à la recombinaison avec le site attI, appelé site attC ou élément 59-base.

Bien que leurs propriétés catalytiques soient apparemment très similaires, 5 " classes " d'intégrons multi-resistants (MRI), définies par la séquence de leur intégrase, ont été décrites à ce jour, toutes véhiculées par des éléments d'ADN mobiles (transposons, plasmides).

Nous avons découvert l'existence d'un autre type d'intégron, les super-intégrons (SI), dans un grand nombre d'espèces des γ-proteobactéries. Ces intégrons possède des caractéristiques communes avec les intégrons multi-résistants, mais ils en diffèrent en 3 points : i) leur taille (plusieurs dizaines de cassettes); ii) la grande homogéneité des sites attC des cassettes qu'il contient ; iii) et par le fait que les fonctions codées par ses cassettes ne sont pas liées à la résistance aux antibiotiques. Nos analyses montrent que ce système est très ancien et que la plate-forme fonctionnelle de ces SIs est sédentaire et qu'elle co-évolue avec les génomes bactériens qui les hébergent. Ces données laissent supposer que les intégrons ont été détournés de leur fonction originelle, encore mal définie, par le développement d'une nouvelle pression de sélection, l'utilisation des antibiotiques par l'homme.

Nous avons proposé un modèle selon lequel l'utilisation des antibiotiques a conduit à la sélection d'intégrons portés par des structures aptes à les disséminer, transposons ou plasmides, à travers la capture d'un gène d'intégrase d'un SI et de son site attI. Sous la contrainte de cette nouvelle pression de sélection, ces intégrons mobiles auraient été capables d'intégrer et propager les cassettes de résistance à partir des réservoirs de cassettes des SIs sédentaires aux fonctions moins spécialisées.

Au cours de cette année, nous avons concentré notre activité sur deux objectifs:

I) Définir les caractéristiques structurales des super-intégrons des Vibrio, en particulier l'établissement de l'inventaire des systèmes poison-antidote présents dans les cassettes.

La comparaison des différents SIs de Vibrio que nous avons réalisé nous a permis de découvrir que tous les SIs hébergeaient plusieurs cassettes exprimant l'un ou l'autre des différents systèmes de mort cellulaire post-ségregationelle (PSK, post-segregational killing, aussi appelés modules d'addiction) découverts dans les plasmides et qui assurent leur maintient dans les cellules filles. Ces cassettes pourraient être une des composantes clefs de la stabilité des rangées de cassettes des SIs. On peut imaginer que les cassettes PSK, qui ne peuvent être perdues sans entraîner la mort des cellules filles, compte tenu de leur dispersion tout au long du SI permettent de contre-sélectionner les délétions qui pourraient se produire entre cassettes répétées.

Nous avons poursuivi l'étude de la fonctionnalité de plusieurs de ces PSK portés par des cassettes (ccdAB de V. fischeri, phd-doc de V. metschnikovii et V. cholerae, ), chez E. coli mais aussi dans leur contexte naturel (V. cholerae et V. fischeri) et montré que ces cassettes portaient un promoteur fort assurant leur expression (ceci est réalisé en collaboration avec le groupe de L. van Melderen, à l'ULB en Belgique).

II) Etude de la dynamique du processus de recombinaison des cassettes dans les super-intégrons, et des partenaires de ces réactions, sites de recombinaison et intégrases

Nous avons poursuivi l'étude des mécanismes de recombinaison dans les intégrons. À la différence des autres Y-recombinases dont l'activité a été caractérisée (l, Cre, XerC/XerD,…), les intégrases d'intégrons ont la propriété unique de recombiner des séquences très peu apparentées. Ce dernier point se reflète directement dans la grande disparité de séquence observée entre les sites attC des différentes cassettes, dont la taille varie entre 57 et 141 nucléotides. Il a été démontré que les intégrations de cassettes se font préférentiellement au site attI, par recombinaison attI x attC, alors que les délétions se font plutôt par recombinaison attC x attC, entre sites de cassettes adjacentes. De plus, il a été démontré que IntI1, l'intégrase d'intégrons la plus étudiée, avait la capacité de recombiner des sites attC structuralement différents mais avec une efficacité faible (au mieux 5.10-2) en comparaison aux autres systèmes catalysés par une Y- recombinase. En 1999, Fernando de la Cruz et ses collaborateurs ont montré que si IntI1 était capable de se lier à un site attI sous forme double brin (db), elle n'avait aucune affinité pour les sites attC db, mais qu'elle reconnaissait exclusivement et avec une forte affinité, le brin " bottom " (bs) du site attC.

Ces caractéristiques nous ont conduit à proposer un modèle pour la recombinaison dans les intégrons impliquant uniquement le brin bs des sites attC structuré en tige-boucle du fait de leur structure palindromique, et un site attI sous forme db. Nous avons obtenu des résultats en faveur de cette hypothèse en utilisant un système de délivrance des substrats de recombinaison fondé sur la conjugaison. En effet, tous les systèmes conjugatifs ont pour propriété d'assurer le transfert par contact cellulaire d'un seul brin - toujours le même- dans la cellule réceptrice. En utilisant cette propriété, nous avons injecté par conjugaison des plasmides suicides portant des sites attC dans une orientation ou l'autre, dans des cellules réceptrices hébergeant un plasmide portant le site partenaire attI et exprimant IntI1. Nous avons observé que le transfert du brin bs conduisait à la formation de co-intégrats aux fréquences habituellement obtenues, alors qu'en conditions de transfert du brin " top " (ts) la fréquence de formation de co-intégrats était réduite d'un facteur 1000. Ceci a conduit à proposer un modèle original impliquant une étape de réplication pour la résolution des co-intégrats (figure). En collaboration avec F.-X. Barre, nous avons pu montrer que ce mécanisme s'appliquait aussi à l'intégration du génome du phage CTX, qui code la toxine cholérique, au site dif du chromosome 1 de V. cholerae. La détermination de la structure cristallographique des complexes entre intégrase d'intégron et substrat simple brin correspondant au bs, réalisée en collaboration avec D. Gopaul, conforte aussi ce modèle, en montrant que dans le complexe synaptique, seules 2 des 4 sous-unités ont une conformation permettant le clivage, les structures des deux sous-unités non-attaquantes étant bloquées par des liaisons avec les bases extra-hélicoidales des sites attC.

B - Séquençage du génome de Vibrio splendidus.

Le second projet développé dans l'unité à trait à l'identification des forces gouvernant la structure et la plasticité des génomes chez les Vibrio. Le genre Vibrio regroupe un grand nombre d'espèces pathogènes pour des hôtes allant de l'homme à un grand nombre d'espèces animales aquatiques. Les quelques espèces caractérisées jusqu'à maintenant ont pour propriété de posséder un génome fractionné en deux chromosomes, et l'analyse évolutive suggère que cette partition en deux molécules est ancienne. Toutefois, la comparaison des chromosomes d'espèces apparentées telles que cholerae et parahaemolyticus montre une grande variabilité dans l'organisation et le contenu de ces chromosomes. L'avantage sélectif conféré par cette organisation est inconnu et cela pose un certain nombre de nouvelles questions fondamentales en ce qui concerne, par exemple, leur ségrégation concertée. Cette partition offre aussi une opportunité unique de manipuler expérimentalement les chromosomes et de mieux comprendre les règles gouvernant leur structuration.

Pour mieux comprendre ces règles nous avons entrepris dans un premier temps, le séquençage complet du génome d'une espèce éloignée de celles déjà séquencée (V. cholerae, parahaemolyticus, vulnificus), V. splendidus souche MEL32 en collaboration avec la PF1 de la génopole de l'Institut Pasteur. Cette bactérie, isolée par l'IFREMER, est responsable d'épisode de mortalité estivale dans les nassains d'huîtres. La radiation phylogénétique des Vibrio comporte deux grandes branches, l'une contient les espèces déjà séquencées et qui sont des pathogènes pour l'homme, alors que l'autre regroupe tous les Vibrio pathogènes ou symbiontes d'animaux aquatiques, dont V. splendidus.

Nous avons maintenant achevé l'assemblage du génome, il est composé de deux chromosomes d'une taille respective de 1676 kb et 3299 kb.

L'analyse comparative des génomes des génomes des différents Vibrio entièrement séquencés, ainsi que l'identification des gènes pouvant être responsable de la pathogénicité pour l'Huître sont en cours de réalisation par plusieurs approches (in silico, hybridations soustractives,…). Cette analyse va nous permettre d'affiner les règles d'organisation et de partition des génomes des Vibrio.

Légendede la photo :

Modèle de recombinaison attC brin " bottom " X attI double brin (d'après Bouvier et al 2005. EMBO Journal 24:4356-67).

Mots-clés: intégron, site-spécifique recombinaison, transferts horizontaux, évolution, Vibrio



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Labouise Odile (labouise@pasteur.fr) Guérout, Anne-Marie, CR1 CNRS, guerout@pasteur.fr

Leroux, Frédérique, CR Ifremer, fleroux@pasteur.fr

Gaëlle DEMARRE (these soutenue en septembre 2005)

Marie BOUVIER (2ère année thèse, MRT fellow)

Johan BINESSE (1ère année thèse, MRT fellow)

Nesrine CHAKROUN (Ingenieur bio-informaticien IFREMER/ CNRS)

Guillaume CAMBRAY, INA PG et M2 génétique P7

Ducos-Galand, Magaly, Technicien, mducos@pasteur.fr

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