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     Microscopie électronique (Plate-forme)


  Responsable : PREVOST Marie-Christine (mprevost@pasteur.fr)


  resume

 

La Plate-Forme de Microscopie Electronique propose des activités de service, de développement de l'analyse ultrastructurale et morphologique en biologie cellulaire, virologie, microbiologie et parasitologie sur différentes thématiques. A cette activité s'ajoutent une méthodologie plus spécialisée pour les localisations immunocytochimiques et les cryofixations ainsi qu'une activité d'enseignement. La PFME s'investit dans la mise en place de nouvelles technologies (cryofixation, marquage en pré-inclusion) permettant d'élargir son domaine d'application et de répondre aux demandes de chercheurs.



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La PFME (Plate-forme de Microscopie Electronique) fait partie du pôle de Dynamique Moléculaire et Fonctionnelle " Imagopôle " dirigé par Spencer Shorte. Elle est directement rattachée au Département de Biologie Cellulaire et Infection (Phillipe Sansonetti) mais est ouverte à tous. Elle a pour mission d'offrir à la communauté pasteurienne la possibilité d'effectuer des études et des travaux sur des sujets pour lesquels l'approche ultrastructurale aura un rôle essentiel dans la thématique de recherche.

Son activité se divise en 3 parties :

Une activité de service pour le contrôle de différents échantillons biologiques (cellules, cellules primaires, virus, bactéries, champignons, parasites…). Techniques d'études ultrastructurales classiques.

Une activité de développement de nouvelles techniques comme, par exemple, la visualisation des marquages immunocytochimiques avec des sondes " nanogold " en pré-inclusion et révélation à l'argent en MET (Martin Sachse).

Egalement, la mise en place (courant 2006) des techniques de cryofixation à haute-pression qui serviront à optimiser la fixation des échantillons observés en MET ou MEB (exemple : la visualisation de "biofilm " qui disparaissent après une fixation chimique " photos 1 ").

Une activité d'enseignement et de formation interne.

Tous les ans nous organisons un cours de formation interne pour 8 à 12 personnes. Ce cours est dédié aux techniciens, ingénieurs, chercheurs du campus et plus récemment aux organismes extérieurs de recherche (OREX). Il permet à ceux qui le souhaitent, de connaître et de se former aux outils et techniques de l'analyse ultrastructurale, afin de les appliquer à leurs propres sujets de recherche.

De plus nous formons régulièrement certains utilisateurs à la manipulation des microscopes et du matériel de la PFME pour les rendre autonomes sur ces techniques.

Les laboratoires sont répartis sur 3 sites. La plate-forme est équipée de quatre microscopes électroniques à transmission (CM10 et CM12 Philips, JEM 1010 et 1200EX Jeol) et d'un microscope à balayage à haute résolution (JSM 6700F avec une cathode à émission froide Cold FEG Jeol). Ce microscope à balayage a été installé en novembre 2002. Il nous permet d'obtenir une résolution de 2 à 3 nm à 1 Kv pour des échantillons biologiques. De même un système de cryotransfert " Gatan Alto 2500 " a été installé sur ce microscope en novembre 2004, ce qui nous permet d'observer des échantillons directement congelés ou cryofracturés. Après congélation dans de l'azote pâteux, nous procédons à une sublimation de la glace puis une métallisation avec différentes cibles (or-palladium, chrome, platine et carbone) sans passer par les fixations chimiques habituelles, ce qui donne une meilleure visualisation de certains échantillons.

Les contrats de collaboration sont validés par un Comité de Pilotage composé de Antony Pugsley, Olivier Schwartz et Jean-Pierre Bourgeois.

La plate-forme propose également, avec l'accord du Directeur de l'Imagopôle et du Comité de Pilotage, de développer de nouvelles technologies et méthodologies dans des domaines plus pointus de l'analyse ultrastructurale telles que les cryotechniques liées à la biologie cellulaire et d'assurer ainsi une veille technologique.

Depuis la création de la Plate-forme de Microscopie Electronique en 2001, nous avons engagé des collaborations avec différentes unités du campus sur des thèmes divers (105 contrats de collaboration). Ces thèmes ont nécessité une approche en microscopie électronique aussi bien sur des techniques classiques que sur des techniques plus spécialisées telles que les immunomarquarges à l'or colloïdal avec différentes approches (cryocoupes, cryofixation et cryosubstitution).

En 2005, nous avons initié 14 contrats de collaboration et nous poursuivons 31 contrats, initiés en 2004 et 2003 qui ne sont pas terminés ou qui sont en cours de finalisation. Actuellement nous avons environ 17 utilisateurs autonomes qui utilisent la PFME dont 7 ont été formés au sein de la plate-forme. La formation d'autres utilisateurs est tout à fait envisageable. Grâce à l'aide financière de Spencer Shorte, nous avons pu organiser et suivre un cours de cryoscanning avec la société Gatan auquel ont participé des utilisateurs internes et externes. De même un cours de formation à la microscopie électronique à balayage avec la société Jeol a eu lieu au sein de la plate-forme pour former 3 personnes de l'équipe et permettre ainsi d'élargir son utilisation afin de mieux répondre aux demandes.

Nous avons également ouvert la plate-forme à l'extérieur du campus en initiant 2 contrats de collaboration qui nécessitaient une analyse en Microscopie Electronique à Balayage, l'un avec Necker et l'autre avec l'Institut Curie.

Voici quelques exemples de projets:

Biologie Cellulaire et Infection

Etude de la surface de Shigella flexneri.

Etude de l'observation directe et indirecte des chaînes latérales polyosidiques du LPS à la surface de Shigella flexneri afin d'identifier le phénotype résultant de mutations de gènes affectant la structure et la composition de cette fraction polyosidique.

Collaboration avec le groupe de Philippe Sansonetti, Unité de Pathogénie Microbienne et Moléculaire.

Immunologie

Etude sur HTLV :

L'étude porte sur la transmission du virus HTLV-1 qui s'effectue essentiellement par contact intercellulaire. Au niveau de la cellule infectée, ce processus se traduit par l'apparition d'une plate-forme d'assemblage du virus HTLV-1 à un pôle cellulaire correspondant au site de contact avec les cellules cibles non infectées. C'est ce phénomène de polarisation et de mise en place de la plate-forme d'assemblage que nous souhaitons étudier par différentes techniques développées au niveau de la PFME.

Collaboration avec le groupe de Andrès Alcover de l'unité de Biologie cellulaire des Lymphocytes et Martin Sachse.

Structure et Dynamique des génomes

Étude sur Aspergillus fumigatus

Une étude porte sur l'analyse d'un biofilm à la surface des colonies d'Aspergillus fumigatus par la technique de cryoscanning (photo 1). L'autre étude porte sur la réactivité de la paroi des conidies et des mycelium d'Aspergillus fumigatus à des récepteurs macrophagiques ( Dectine 1, etc).

Collaboration avec le groupe de Jean-Paul Latgé de l'unité des Aspergillus.

Légendes des photos :

Visualisation du Biofilm chez Aspergillus fumigatus après congélation en microscopie électronique à balayage

" Jeol 6700F " équipée d'un cryotransfert Gatan " Alto 2500 " : A. Beauvais, S. Guadagnini, JP Latgé , M-C Prévost.

Mots-clés: Microscopie Electronique, Ultrastructure, Immunomarquage, cryocoupes, cryofixation



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Pacaud Christiane chrispac@pasteur.fr Mme Sophie Kernéis-Golsteyn Chargée de recherche CR skerneis@pasteur.fr   Prévost Marie-Christine, Ingénieur de Recherche position III, mprevost@pasteur.fr

Sachse Martin, Ingénieur de Recherche position II, msachse@pasteur.fr

Bonne Isabelle, Ingénieur de Recherche position II, ibonne@pasteur.fr

Guadagnini Stéphanie, Technicienne supérieure 1D, sgiroux@pasteur.fr

Schmitt Christine, Technicienne de laboratoire qualifiée, cschmitt@pasteur.fr

Cayet Nadège, Technicienne de laboratoire qualifiée, ncayet@pasteur.fr

Viley Christine, Agent de laboratoire


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