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     Résonance Magnétique Nucléaire - URA CNRS 2185


  Responsable : DELEPIERRE Muriel (murield@pasteur.fr)


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La thématique de l'Unité concerne l'étude structurale et dynamique des macromolécules biologiques en solution en relation avec leur fonction, ainsi que l'étude des interactions impliquées dans les phénomènes de reconnaissance moléculaire de type DNA-protéine, protéine-protéine ou encore ligand-macromolécules. Les approches sont celles de la Biochimie et de la Biophysique, avec comme méthode de choix mais sans exclusive, la Résonance Magnétique Nucléaire. Les thèmes développés le sont en étroite collaboration avec des équipes de l'Institut Pasteur.



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Étude structurale et fonctionnelle des protéines bactériennes impliquées dans l'acquisition de l‘hème (Célia Caillet, Julien Lefevre, Izadi-Pruneyre, Anne Lecroisey, Karine Wecker, Nicolas Wolff)

Le fer, impliqué dans de nombreux processus biologiques, est indispensable pour les êtres vivants. Bien que très abondant, il est quasiment insoluble dans les milieux biologiques. Chez les bactéries à Gram négatif, l'acquisition de l'hème, source majeure de fer, peut se faire par l'intermédiaire d'une protéine extracellulaire appelée hémophore, qui capte l'hème avec une très grande affinité et le retourne à un récepteur spécifique de la membrane externe. Les hémophores aussi appelés HasA forment une nouvelle famille d'hémoprotéines sans homologie avec d'autres protéines connues et sont présents chez Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Yersinia pestis et Yersinia enterocolitica. La structure tridimensionnelle de HasASm (19 kDa), sécrété par S. marcescens, a été déterminée par diffraction aux rayons X (forme hémo-) et par RMN hétéronucléaire multidimensionnelle (forme apo-).Trois résidus sont impliqués dans la fixation de l'hème : une histidine et une tyrosine directement liées au fer de l'hème et une autre histidine via la tyrosine. L'importance et le rôle de chacun de ces résidus dans l'activité de la protéine ont été évalués en absence et en présence du ligand à partir de l'étude des propriétés physico-chimiques et moléculaires de mutants ainsi que de leurs propriétés paramagnétiques. L'ensemble de ces travaux nous ont permis d'émettre des hypothèses sur les mécanismes de capture et de délivrance de l'hème de cette nouvelle famille de protéines. (Collaborations : Unité des membranes bactériennes, Institut Pasteur ; CNRS et Faculté de Pharmacie, Marseille, Université de Florence, Italie)

Une forme dimérique de HasASm, HasAD, sécrétée par Serratia marcesens ayant été mise en évidence et caractérisée, sa structure a été déterminée (collaboration Mirjam Czjzek station biologique de Roscoff). La structure tertiaire de chaque monomère est semblable à celle du monomère seul cependant la région comprenant les résidus 2-49 est échangée entre les deux chaînes polypeptidiques, " domain swapping " (figure 1). L'un des ligands de l'hème (His32) appartient au segment peptidique échangé ce qui pourrait contribuer à diminuer son affinité pour l'hème par rapport au monomère (9. 108 M-2 vs 5,3 1010M-1). Cette affinité reste néanmoins plus élevée que celle de la plupart des transporteurs d'hème présents chez l'hôte. HasAD pourrait jouer le rôle de réservoir à hème dans le système hémophore.

Si le système Has de S. marcescens est maintenant bien caractérisé, au niveau moléculaire, les différentes étapes d'acquisition et d'internalisation de l'hème restent encore incomprises. HasASm fixe l'hème libre ou lié à des hémoprotéines avec une très grande affinité et le délivre ensuite à un récepteur membranaire spécifique HasR d'affinité moindre pour l'hème. Nous avons récemment montré qu'un complexe se formait entre les deux protéines et que le transfert de l'hème s'effectuait sans apport d'énergie. En revanche, les étapes ultérieures du transfert à savoir l'internalisation de l'hème, l'éjection de l'hémophore déchargé de son hème et la transduction du signal induisant la régulation du système sont des étapes nécessitant de l'énergie apportée par une protéine de la membrane interne HasB. La protéine HasB est homologue de TonB qui fournit de l'énergie dérivée de la force proton motrice nécessaire au fonctionnement de nombreux récepteurs de la membrane externe homologues de HasR. Alors que ces deux protéines partagent 25% d'identité de séquence et sont partiellement redondantes au niveau fonctionnel, HasB est spécifique de l'acquisition de l'hème via l'hémophore. Les bases moléculaires de cette spécificité ne sont pas connues. L'objectif est donc de comprendre la spécificité de HasB dans le système HasA en déterminant la structure en solution de sa région périplasmique et en la comparant à celle de TonB. Nous avons clôné, surexprimé et marqué isotopiquement le domaine périplasmique de HasB correspondant aux 130 résidus C-terminaux. et l'étude de sa structure en solution a débuté (Collaboration : Unité des Membranes bactériennes Institut Pasteur)

Étude structurale de déterminants antigéniques reconnus par un anticorps monoclonal protecteur dans le cadre du développement d'un vaccin contre la shigellose (François Theillet, Ada Prochnicka-Chalufour, Catherine Simenel, Muriel Delepierre)

Shigella flexneri est une bactérie à gram négatif responsable de la forme endémique de la shigellose, une infection recto-colique aiguë dont les principales victimes sont les enfants de moins de cinq ans dans les pays en voie de développement. L'augmentation, du nombre de souches de Shigella résistantes aux antibiotiques, rend la vaccination l'unique moyen d'éradication de la maladie. La protection contre une infection par Shigella repose essentiellement sur la réponse humorale locale dirigée contre la partie polyosidique du lypopolysaccharide appelée antigène-O (Ag-O). De plus, les anticorps conférant cette protection sont spécifiques du sérotype de la souche de Shigella définie par la structure de l'Ag-O. Une stratégie possible pour la vaccination humaine consiste donc à développer des vaccins synthétiques chimiquement définis avec des molécules simples capables de mimer l'Ag-O et d'induire la synthèse d'anticorps protecteurs. Deux approches ont été développées qui consistent à utiliser soit des oligosaccharides synthétiques représentatifs des épitopes osidiques reconnus par des anticorps protecteurs soit des séquences peptidiques mimant les épitopes protecteurs. Le développement de chacune de ces deux options requiert une étude structurale de l'interaction des oligosaccharides et des peptides avec des anticorps protecteurs afin d'appréhender les bases moléculaires impliquées dans la reconnaissance antigène-anticorps et à définir ainsi la structure optimale mimant l'Ag-O. Les structures en solution des oligosaccharides synthétiques, de l'antigène-O du sérotype 5a et des séquences peptidiques immunogéniques ont été étudiées par RMN soit sous forme libre soit sous forme liée à des anticorps protecteurs permettant de mettre en évidence le rôle du résidu glucosyl dans la structuration en hélice observée. Ces études sont maintenant étendues à la caractérisation des épitopes oligosaccharidiques du sérotype 2a (collaboration avec les Unités de Pathologie Microbienne et de Chimie Organique).

Étude structure-fonction de la protéine TgDRE, une enzyme de réparation de l'ADN exprimée par le parasite Toxoplasma gondii (Karine Frénal, Karine Wecker, Nicolas Wolff)

Le protozoaire Toxoplasma gondii est un parasite pathogène opportuniste appartenant au même phylum que le Plasmodium falciparum et responsable de la toxoplasmose chez l'homme. Son infection est asymptomatique dans la plupart des cas, mais le parasite persiste à vie sous forme latente enkystée au niveau des cellules nerveuses, rétiniennes et musculaires. Toutefois, chez les personnes immunodéprimées (cancer, sida, greffe), la forme quiescente entre en réplication active, devient virulente et peut causer la mort par encéphalite. L'interconversion entre ces deux formes est donc importante dans la réactivation de l'infection. Il semble que certains stimuli comme l'oxyde d'azote ou l'interféron γ soient impliqués dans le passage de la forme virulente à la forme latente, ce qui pourrait causer un stress pour le parasite et être à l'origine de dommages au niveau de son ADN. Une protéine de réparation de l'ADN récemment découverte chez le parasite Toxoplasma gondii, nommée TgDRE (Toxoplasma gondii DNA Repair Enzyme) serait impliquée dans l'interconversion des formes quiescente et virulente du parasite. Constituée de 466 résidus, elle forme avec quatre autres protéines une nouvelle famille caractérisée par la présence de trois domaines : deux domaines de liaison à l'ARN : les G-patch et RRM (RNA Recognition Motif) et un domaine nommé SF45 par homologie avec un domaine de la protéine humaine SF45 impliquée dans le spliceosome. Après avoir réalisé des constructions plasmidiques, exprimé et purifié des protéines mono et multidomaines de TgDRE (de 7 kDa à 25 kDa) nous avons déterminé la structure par RMN des domaines constructions stables conjointement à leur étude fonctionnelle (Collaboration Laboratoire de Minéralogie-Cristallographie de Paris, Jussieu, DIEP, CEA-Saclay, Unité Parasitologie Moléculaire, Université de Lille, Unité de Chimie Organique Institut Pasteur).

Structure et fonction de régulateurs de la transcription issus de virus d'archées hyperthermophiles (Florence Guillière, Iñaki Guijarro)

Les virus d'archées hyperthermophiles montrent une diversité exceptionnelle et sont très différents des virus de bactéries et d'eucaryotes. La position particulière de leurs hôtes dans l'évolution, leur très grande diversité et leurs différences par rapport au reste des organismes (90% des protéines prédites de ces virus ne présentent aucun homologue dans les bases de données), rendent l'étude de ces virus très attractive. Nous avons débuté, l'étude de la structure et de la fonction de protéines pouvant être impliquées dans la régulation de la transcription. En effet, la transcription chez les archées est à l'heure actuelle peu connue. De façon intéressante, la machinerie de base est une version simplifiée de celle des eucaryotes (ARN polymérase et facteurs TBP, TFB, et TFE) alors que les facteurs de régulation de la transcription ressemblent à ceux des bactéries. Ce projet s'inscrit dans un projet plus vaste qui vise à étudier ces virus pour essayer d'en comprendre leur fonctionnement et leurs relations avec leurs hôtes. Deux protéines ont été initialement étudiées. La première, nommée D56, provient du virus SIRV1 (" Sulfolobus islandicus rudivirus 1 "). Cette protéine, exprimée tout au long du cycle d'infection, lie de façon spécifique la région de son propre promoteur et celle de son gène voisin. La deuxième protéine, Sta1, provient de l'hôte de SIRV1 (S. islandicus). Sta1, qui est produite en réponse à un stress, stimule la transcription de gènes du virus SIRV1 lors de l'infection. Nous avons établi un modèle de la structure de Sta1 et nous raffinons la structure de D56, dans l'optique d'étudier son interaction avec son ADN cible. (collabortation : Unité de Biologie Moléculaire du Gène chez les Extrêmophiles)

Légendes des photos :

Structure tridimensionnelle du dimère de la protéine HasASm déterminée par diffraction de rayon X. Les fragments polypeptidiques échangés sont en couleur

Mots-clés: Biophysique, RMN, structure, interactions, biomolécules, modélisation moléculaire



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LECROISEY Anne (IP) CR alecrois@pasteur.fr

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CAILLET Célia Thèse 2ième année ccaillet@pasteur.fr

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GUILLIERE Florence thèse 1ère année floguili@pasteur.fr

LEFEVRE Julien Thèse 2ière année

THEILLET François thèse 1ère année



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