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     Immunopathologie Virale - URA CNRS 1930


  Responsable : Rivière Yves (riviere@pasteur.fr)


  resume

 

Notre projet de recherche est essentiellement axé sur l'étude du rôle des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) dans la pathogénèse des infections virales de l'homme et en particulier de l'infection par virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) et par le virus de l'hépatite C (VHC). Plusieurs approches sont développées in vitro: cartographie des épitopes T et importance des réactivités croisées, présentation de particules virales exogènes aux CTL, contrôle de la réplication virale, et in vivo : reconstitution du système immunitaire dans des cohortes de patients infectés et traités par anti-rétroviraux, importance de l'induction de CTL dans l'efficacité des protocoles de vaccination dans des modèles animaux.



  rapport

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A . Reconstitution immunitaire chez l'enfant infecté par le VIH et traité par multithérapie antirétrovirale F Buseyne, E Monchatre, en coll. avec D Scott-Algara (IP) et S Blanche, M Burgard, C Rouzioux (CHU Necker), et J. LeChenadec, J. Warsawski (Inserm, CHU Bicêtre).

Depuis plusieurs années nous étudions une cohorte d'enfants infectés par voie materno-fœtale suivis par le Pr. Stéphane Blanche à Necker. Une partie importante des enfants participent à des protocoles de thérapie anti-rétrovirale (ART) combinée avec ou sans anti-protéase. L'efficacité des traitements anti-viraux est évaluée par la mesure de la charge virale (plasmatique, virémie cellulaire et provirus intégré) dans le laboratoire du Pr. Christine Rouzioux à Necker. Chez l'enfant, du fait de la réplication virale plus élevée et d'une thymopoièse plus active, l'impact des ART sur le système immunitaire est différent de celui observé chez l'adulte. L'objectif du travail est d'étudier la reconstitution immunitaire chez l'enfant infecté et recevant des traitements antirétroviraux (ART).

Notre but est de quantifier les différentes sous populations de lymphocytes T CD4+ et CD8+, ainsi que les fonctions de ces lymphocytes, et en particulier les lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus, en relation avec les modifications de la charge virale induites par les traitements. Les effets des traitements antirétroviraux sont étudiés au cours de l'infection néonatale ainsi que chez l'enfant après plusieurs années d'infection. Les activités des lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus sont évaluées par différentes méthodes incluant la technique Elispot (Buseyne et Coll., J Immunol Methods 2005), et l'analyse en cytométrie combinant marquage intracellulaire de cytokines et marquage de surface par tétramères (Scott Algara et Coll., J Clin Immunol.2005). Notre but est d'évaluer la reconstitution des réponses immunitaires chez l'enfant en fonction de son âge et du degré d'immunosuppression de l'organisme à l'initiation du traitement. Compte tenu des effets secondaires potentiels des traitements anti-rétroviraux continus, ces informations sont importantes pour l'établissement du moment optimal pour initier les traitements anti-rétroviraux. Nous avons montré chez les patients recevant une première ligne de multithérapie combinée que le niveau des activités T cytotoxiques mémoire en début de traitement est inversement corrélé avec la virémie plasmatique après 12 mois de traitement indépendamment de la virémie au début du traitement (Buseyne et Coll., AIDS Res Hum Retro 2005). D'autre part, la mesure de la production d'IFNg par les lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH par Elispot a montré une augmentation des réponses avec l'âge chez les enfants traités et non traités. Chez les enfants recevant une multithérapie anti-rétrovirale la réduction de la virémie était associée à une diminution des réponses T CD8+ (Buseyne et Coll., JID 2005).

L'utilisation de tétramères de la molécule HLA-A2 complexés avec deux peptides immunodominants de la p17(Gag) et de la RT (Pol) nous avait permis de montrer que la grande majorité des PBMC des enfants HLA-A2 testés fixent le tétramère Gag et le tétramère Pol. Nous avons complété cette étude en montrant qu'une fraction importante des lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH, détectés par leur attachement à des complexes tétramères peptides, a un déficit fonctionnel multiple car une proportion importante est incapable, à la suite d'une stimulation antigénique spécifique, de sécréter de l'IFNg, du TNFa RANTES et/ou du MIP-1b. Il existe une corrélation négative entre la charge virale plasmatique et la présence de lymphocytes T CD8+ tétramères + et IFNg + (Scott-Algara et Coll., J Clin Immunol, 2005). Ces dysfonctions pourraient avoir un rôle dans l'immunopathologie de l'infection chronique par le VIH.

B . Présentation de particules virales du VIH exogènes aux lymphocytes CD8+: rôle des particules virales non réplicative dans l'induction d'effecteurs CD8+. F Buseyne,C Retiere,M. Nowakowski en coll avec A Morris, O Schwartz (IP) et J.P Abastado (IDM, Paris). Les cellules dendritiques et les macrophages présentent les particules du VIH aux lymphocytes T CD8+ en absence de réplication virale. Le projet a pour objectif de déterminer le rôle des particules du VIH non réplicatives dans l'induction de lymphocytes T CD8+ spécifiques du virus. Pour déterminer le rôle des particules virales non infectieuses dans l'induction de lymphocytes T CD8+ spécifiques du VIH, des cellules dendritiques incubées avec des particules virales non réplicatives exogènes et des cellules dendritiques infectées productivement seront comparées pour leur capacité à induire des lymphocytes T CD8+ anti-VIH in vitro.

C. Modèles animaux: immunisation à base d'ADNs chez le macaque. En collaboration avec A.L Puaux et M.L Michel (INSERM U163, Institut Pasteur), R LeGrand (CEA, Fontenay) et AM Aubertin (INSERM, Strasbourg).

Comme approche vaccinale pour lutter contre l'infection par le VIH-1 deux stratégies sont combinées : d'une part, pour favoriser la réponse humorale et cellulaire, un système de présentation d'épitopes utilisant comme molécule porteuse l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (AgHBs); d'autre part, pour stimuler la réponse cytotoxique, une vaccination à base d'ADN utilisant des vecteurs codant pour des domaines antigéniques de SIV et de VIH-1 fusionnés à cet antigène (Marsac et Coll 2005). Le macaque est le modèle animal utilisé dans cette étude puisqu'il présente l'avantage de pouvoir être éprouvé par infection avec un virus chimérique SHIV portant l'enveloppe de VIH-1. L'immunogénicité de nouveaux vecteurs ADN codant pour des domaines antigéniques de l'enveloppe de VIH-1, de la capside et de la protéine nef de SIV a été étudiée. Une épreuve virulente a été effectuée avec un virus chimère SHIV portant l'enveloppe d'un isolat bitropique. Les réponses T induites par l'ADN hybrides ont été rappelées par une injection de MVA recombinant. Les macaques immunisés sont infectés mais ont montré une protection partielle contre l'épreuve virulente attesté par le contrôle de la charge virale plasmatique (Puaux et Coll. Vaccine, 2004) . Nous avons déterminé le devenir, après infection, des réponses cellulaires T induites par les immunisations. Les réponses lymphocytaires T CD8+ ont été rappelées pendant l'infection aiguë, mais aucune des réactivités T CD4+ induites par les immunisations n'a été rappelée (0/7 epitopes). De plus, la plupart de ces réactivités (5/7 epitopes) deviennent indétectables dans le sang périphérique et les ganglions lymphatiques, même après stimulation peptidique in vitro. Les réponses spécifiques d'antigènes de rappel persistent chez les animaux infectés. Ces résultats montrent que l'épreuve par SHIV 89.6P altère la fonction des lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus et induites par des immunisations préventives et suggèrent que ces réponses doivent être considérées lors de mise au point de nouveaux vaccins (Puaux et Coll AIDS 2005).

D. Réponses cellulaires T spécifiques du virus de l'hépatite C (VHC) chez des sujets infectés porteurs chroniques G Janvier, S Ferris en collaboration avec S Pol, H Fontaine, ML Chaix, JL Bresson (CHU Necker).

Le VHC est un virus à ARN de la famille des flaviviridae. Ce virus est responsable de plus de 90% des hépatites post-transfusionnelles. L'infection par le virus de l'hépatite C est donc un problème de santé publique. Dans l'infection par le VHC, la réponse immune joue un rôle important dans l'élimination du virus ou la persistance virale. Pendant la phase aiguë, les réponses T corrèlent avec l'élimination du virus. L'évolution vers une infection chronique est associée à l'affaiblissement des réponses immunes médiées par les cellules T. Les thérapeutiques actuellement disponibles ne permettent d'envisager une éradication virale que chez environ 50 % des personnes traitées. Les tentatives de mise au point vaccinales sont pour l'instant en échec principalement du fait de la variabilité virale et d'une réponse immunitaire non protectrice chez lamajorité des sujets chroniquement infectés. Compte tenu de la faible fréquence de détection ex vivo des réponses T chez les porteurs chroniques de VHC, nous avons caractérisé les réponses T à l'aide d'un test Elispot interféron-g après stimulations in vitro par des peptides spécifiques (15 mers) de la séquence du core de lymphocytes circulants (PBMC) d'un groupe de 22 adultes non traités. Le choix de la protéine core était fondé sur sa conservation parmi les différents génotypes de VHC. Nous avons montré que les réponses étaient dirigées majoritairement contre les régions centrale et C-terminale de la protéine. Les effecteurs sont des lymphocytes T CD8+. La présence de lymphocytes spécifiques du core était corrélée positivement avec la charge virale plasmatique. Nous n'avons pas observé de corrélation entre la présence d'effecteurs spécifiques et les lésions histologiques du foie (score metavir A et F) ou le taux sérique des alanines transaminases (Janvier et Coll., Virology 2005).

Mots-clés: VHC, CTL, VIH-1, Enfant, Reconstitution immunitaire, Présentation antigénique



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Josiane VILLENEUVE IP (jvillene@pasteur.fr) BUSEYNE Florence, IP (florence@pasteur.fr)

RIVIERE Yves , IP (riviere@pasteur.fr)

AUCHER Anne Stagiaire DEA (aaucher@pasteur.fr)

LAARIF Rim Stagiaire M2 (rim@pasteur.fr)

JOLY Etienne , Stagiaire CR INSERM

RETIERE Christelle, Stagiaire post doctoral (retiere@pasteur.fr)

COQUELIN Anne Sophie Stagiaire ESTBA (acoquelin@pasteur.fr)

JANVIER Geneviève, technicienne IP (gjanvier@pasteur.fr)

MONCHATRE Elisabeth, technicienne IP (emonchat@pasteur.fr)

NOWAKOWSKI Mireille, technicienne IP (mnowak@pasteur.fr)


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