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     Typage et Séquençage des Virus des Hépatites


  Responsable : Christian Bréchot, Valérie Thiers (brechot@vjf.inserm.fr, vthiers@pasteur.fr)


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Les travaux de notre laboratoire et du Centre National de Référence sur les Hépatites virales B et C, sont centrés sur la mise en place de nouvelles approches méthodologiques pour l'analyse des infections par les virus des hépatites B (VHB) et C (VHC). En étroite collaboration avec l'unité mixte Inserm 370/Pasteur, nous développons un projet ayant pour objectif d'étudier à partir de cellules hépatocytaires isolées par microdissection laser chez des sujets ayant développé un CHC sur cirrhose virale C, la variabilité intra-hépatique de la capside du VHC et le protéome de ces cellules hépatocytaires. Parallèlement, le Centre de Référence contribue à la surveillance moléculaire et à l'identification des risques résiduels de transmission de ces virus.



  rapport

cale

Le VHC est un des facteurs impliqué dans la survenue du carcinome hépatocellulaire (CHC). L'identification des gènes dont l'expression est modulée lors des différentes étapes de l'infection chronique par le VHC, est essentielle pour la compréhension des mécanismes conduisant au développement d'un CHC et pour l'identification de nouveaux marqueurs diagnostiques et/ou pronostiques.

Le foie est un tissu hétérogène dont l'architecture se modifie au cours de ce processus pathologique. La microdissection laser permet d'isoler à partir d'un fragment hépatique, des groupes d'hépatocytes parfaitement caractérisés. Notre projet avait pour objectif d'associer les techniques de microdissection laser sur des fragments hépatiques de CHC lié au VHC pour deux types d'études : (1) l'analyse de la variabilité intra-hépatique de la capside du VHC et (2) l'analyse des modifications du protéome hépatocytaire.

1 Etude des variants de la capside du VHC, protéine virale potentiellement impliquée dans la carcinogenèse hépatique (R. SOBESKY, N. DERIAN, V. THIERS).

Des travaux réalisés au laboratoire, sur un petit nombre de cas (n=4), ont montré que des protéines de capside isolées à partir de cellules tumorales, différant de quelques acides aminés de celles isolées de la non-tumeur, présentaient des effets biologiques différents sur certaines voie de signalisation cellulaire (Delhem et al, 2001, Oncogene ; Pavio et al., 2005 Oncogene). Ces travaux suggèrent l'existence d'une distribution des quasi-espèces différentes dans la tumeur, ouvrant la possibilité d'une sélection de souches ayant des propriétés fonctionnelles modifiées. L'identification chez d'autres sujets avec CHC, de quasi-espèces possédant des propriétés similaires seraient en faveur d'une sélection de variants viraux au cours de l'infection chronique. Notre projet repose sur l'identification " in situ " de séquences de capside du VHC dans des CHC. Après capture par microdissection laser de groupes d'hépatocytes adjacents dans la zone tumorale (T) et dans deux nodules cirrhotiques distincts (NT1, NT2) les séquences complètes de la capside ont été clonées pour 7 patients avec CHC infectés par un VHC de génotype 1b. Pour chaque zone étudiée, une dizaine de clones a été séquencée. La comparaison des séquences obtenues pour chaque patient a montré une hétérogénéité de la protéine capside entre les trois zones étudiées chez 5/7 patients, avec une variabilité, plus marquée bien que limitée, dans la région tumorale. La présence de quasi-espèces différentes en fonction de la zone étudiée suggère l'existence de compartiments viraux indépendants à l'intérieur du foie et suppose une évolution spécifique des variants dans chaque zone. L'impact biologique de ces quelques mutations reste à déterminer. Les séquences majoritaires de la protéine de Capside, issues des zones NT1, NT2 et T seront testées pour leur effet biologique sur certaines voies de signalisation cellulaire. Ces séquences seront co-transfectées de façon indépendantes avec un système de gène rapporteur de l'activité de la voie de signalisation du TGF-ß, cytokine impliquée dans l'inhibition de la prolifération cellulaire, et le niveau de stimulation après traitement au TGF-ß sera mesuré.

2 Analyse du protéome de patients infectés par le VHC atteints de CHC à partir d'hépatocytes isolés par microdissection (A. DOS SANTOS, F. DEMAUGRE & V THIERS)

Notre projet est centré sur l'étude comparative des protéomes d'hépatocytes tumoraux et non-tumoraux isolés par microdissection laser, à partir de coupes histologiques congelées. L'approche repose sur l'association de l'électrophorèse bi-dimensionnelle (2D-PAGE) et de la spectrométrie de masse pour identifier les protéines différentiellement exprimées dans le CHC lié au VHC (projet ARECA - ARC/Inserm). Les fragments tissulaires inclus dans cette étude ont été obtenus de la Collection Nationale des hépatocarcinomes (Inserm/DHOS). Pour déterminer l'apport de la microdissection laser sur l'établissement du profil d'expression différentiel, nous avons comparé les profils protéiques des zones tumorale (T) et non tumorale (NT), réalisés à partir de cellules microdisséquées et de lames entières. L'analyse bioinformatique des gels (réalisés en triple) nous a permis de déterminer le profil d'expression différentiel de chacune des conditions étudiées (microdissequé/lame entière). Après analyse bioinformatique des gels, un profil d'expression différentiel T/NT a été établi pour la condition " microdissecqué " et " lames entières ". La comparaison de ces profils montre que la microdissection laser permet de faire ressortir des protéines dérégulées qui sont masquées quand le profil est établit à partir de lysats tissulaires totaux. En effet, 30% des protéines différentiellement exprimées sur les extraits microdisséqués, ne sont pas dérégulées quand l'analyse est effectuée sur des extraits globaux. De plus, les rapports d'expression entre la zone T et NT sont plus élevés pour les cellules microdisséquées par comparaison aux rapports observés pour les lames entières (p<0,001). Les protéines différentiellement exprimées ont été identifiées par spectrométrie de masse (MALDI-TOF ; collaboration avec l'unité Inserm U467) et l'expression de certaines d'entre elles a été validée par Western blot. Cependant l'expression modifiée des protéines identifiées est à montrer sur un plus grand nombre de patients afin de démontrer leur possible intérêt comme marqueur potentiel du CHC.

Ces observations suggèrent que la microdissection permet de circonvenir l'hétérogénéité cellulaire du foie cirrhotique et apporte un réel enrichissement des protéines d'intérêt. Elles valident le choix de la microdissection dans notre étude et démontrent sa faisabilité.

3 Activité du CNR Hépatites virales B et C (F. RIMLINGER, V. THIERS)

Les projets de recherche du laboratoire mixte sont également associés aux activités menées par le CNR. Les données moléculaires, par le biais d'analyses phylogénétique, sont utilisées pour " tracer " l'origine de certaines infections virales et permettent d'affirmer ou d'infirmer des hypothèses concernant les modes de transmission. Des études visant à l'analyse des modes résiduels de transmission des VHB et VHC sont en cours : Investigation d'épisodes de transmission nosocomiale en collaboration avec l'Institut de Veille Sanitaire ; étude de l'épidémiologie moléculaire du virus de l'hépatite C dans des zones géographiques diverses en collaboration avec le réseau HEPMED (projet CEE coordonné par B. Larouzé) et le réseau des Instituts Pasteur (PTR coordonné par Pénélope Mavromara, IP de Grèce).

Mots-clés: VIRUS DE L’HEPATITE C (VHC), VARIABILITE GENETIQUE, CARCINOME HEPATOCELLULAIRE (CHC), MICRODISSECTION LASER, PROTEOME, ELECTROPHORESE BIMENTIONNELLE (2D-PAGE), EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
    BRECHOT Christian, PUPH INSERM, brechot@vjf.inserm.fr SOBESKY Rodolphe, Médecin, étudiant en thèse

DERIAN Nicolas étudiant Master

THIERS Valérie, Ingénieur, vthiers@pasteur.fr

RIMLINGER François, Technicien, frimling@pasteur.fr

DOS SANTOS Alexandre , Technicien, ads@pasteur.fr


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