Portail IP   bandeau_genéral
imprimer
Imprimer
     Génétique Moléculaire du Développement - CNRS URA 2578


  Responsable : BUCKINGHAM Margaret (margab@pasteur.fr)


  resume

 

Nos recherches sont centrées d'une part sur l'étude de la myogenèse dans le but de comprendre comment les cellules progénitrices sont spécifiées chez l'embryon pour permettre la mise en place de différentes masses musculaires du squelette. Nous sommes également intéressés par les cellules progénitrices du muscle chez l'adulte et l'éventuelle contribution de cellules souches à la régénération. D'autre part, nous étudions la cardiogenèse avec l'analyse des différentes populations précurseurs du myocarde et leur contribution à la morphogenèse du cœur. Le modèle expérimental est la souris, manipulée par les approches de génétique moléculaire.



  rapport

cale

La formation du muscle de squelette

Les gènes Myf5 et Mrf4, ainsi que Pax3 et son paralogue Pax7, se situent en haut de la hiérarchie génétique qui détermine l'entrée d'une cellule dans la voie de différenciation musculaire. Myf5 et Mrf4 font partie de la famille de facteurs de régulation myogénique (Myf5, Mrf4, MyoD, Myogénine) à motif b-HLH, tandis que Pax3 appartient à la famille des facteurs de transcription à boîte homéo, les Pax, dont différents membres jouent un rôle clé dans l'organogenèse et l'apparition de cellules spécialisées, pendant le développement.

Les gènes Pax et les cellules progénitrices du muscle chez l'embryon

[M. Lagha, F. Relaix, D. Rocancourt, en collaboration avec A. Mansouri (Göttingen)]

Les rapporteurs nlacZ et GFP que nous avons introduits dans Pax3, marquent les cellules qui expriment ce gène pendant le développement. Dans le cas de Pax7, l'existence d'un anticorps fiable, ainsi que la disponibilité de souris Pax7LacZ/+ fournit les outils pour suivre son expression. Nous avons constaté la présence de cellules Pax3+, Pax7+, qui n'expriment pas les marqueurs myogéniques et qui se divisent, à l'intérieur des masses musculaires. Ces cellules sont présentes d'abord dans la région centrale du dermomyotome, structure épithéliale du somite dorsal dont dérivent les cellules musculaires, puis dans toutes les masses musculaires de l'embryon tardif et du fœtus. La stabilité du rapporteur GFP permet de démontrer que les cellules qui ont exprimé Pax3 deviennent les myoblastes, avec activation des gènes de détermination myogéniques, Myf5 et MyoD, et se différencient ensuite en fibres musculaires. Chez les doubles mutants, Pax3-/-/Pax7-/-, ces cellules ne réalisent pas leur destin myogénique, mais meurent ou sont incorporées dans d'autres tissus tel l'os des côtes. En l'absence de ces cellules progénitrices il y a un déficit majeur du muscle de squelette ; seuls les muscles issus de la première vague de myogenèse chez l'embryon se forment, indépendamment des gènes Pax3/7. Cette myogenèse précoce dépend de Myf5 et aussi de Mrf4, mais ensuite la formation et la croissance musculaires dépendent des cellules progénitrices Pax3+/Pax7+.

Le rôle de Pax3 et Pax7 dans les cellules satellites du muscle adulte

[D. Montarras, F. Relaix, S. Zaffran, en collaboration avec A. Mansouri (Göttingen), S. Tajbakhsh et B. Gayraud-Morel (Institut Pasteur) et A. Cumano (Institut Pasteur)]

La croissance postnatale et la régénération du muscle adulte dépendent des cellules satellites. Comme les cellules progénitrices du muscle fœtal, qui assument la position "satellite" sous la lame basale des fibres musculaires, ils expriment Pax7. Chez les mutants Pax7-/- les cellules satellites sont initialement présentes, donc spécifiées, mais progressivement perdues. Pax3, qui est également exprimé dans les cellules satellites de la plupart des muscles, visualisé par l'expression des gènes rapporteurs, ne sauve pas cette situation. Nous démontrons que les cellules satellites meurent en l'absence de Pax7. L'effet anti-apoptotique de Pax7 est démontré par la mort de cellules satellites en culture après infection avec un adénovirus exprimant Pax7-En qui agit comme une forme dominante négative de Pax7. Pax3-En n'a pas les mêmes effets. Nous concluons que Pax7 joue un rôle anti-apoptotique et que Pax3 n'exerce pas cette fonction dans ces cellules progénitrices adultes. Par contre, Pax3 et Pax7 jouent un rôle dans l'activation de MyoD, régulant ainsi l'entrée d'une cellule satellite dans le programme myogénique. Myf5 joue également ce rôle indépendemment des Pax et c'est seulement dans les cellules satellites provenant de souris Myf5-/-, en présence de Pax3-En/Pax7-En que la myogenèse n'a pas lieu.

Isolement des cellules satellites à partir des souris Pax3GFP/+

[D. Montarras, F. Relaix, en collaboration avec A. Cumano (Institut Pasteur), J. Morgan et T. Partridge (Londres)]

Chez la souris Pax3GFP/+ les cellules satellites de la plupart des muscles sont GFP+. Nous avons séparé ces cellules par cytométrie de flux et analysé leurs propriétés à la fois in vitro et in vivo. En culture, l'analyse clonale montre qu'il s'agit d'une population qui forme les cellules musculaires à >95%. In vivo, après greffe de ces cellules dans les muscles dégénérés de la souris mdx, nous constatons une forte contribution à la régénération du muscle, marqué par l'expression de la dystrophine, absente chez les souris mdx. La réserve de cellules satellites du muscle est également reconstituée. La comparaison d'efficacité régénérative après greffe de différentes préparations de cellules GFP+ démontre l'intérêt d'utiliser les cellules purifiées avant leur mise en culture. L'isolement des cellules Pax3+ nous a permis de définir les paramètres de taille et granulosité, utilisés ensuite pour isoler les cellules provenant des souris sauvages. Ces cellules se comportent comme les cellules satellites à la fois in vitro et in vivo. Nous concluons que les cellules satellites sont les cellules progénitrices du muscle adulte avec un fort potentiel régénératif.

La régulation du gène Myf5 et les cibles de Pax3

[L. Bajard, C. Crist, P. Daubas, M. Lagha, F. Relaix, D. Rocancourt, S. Vincent]

L'analyse des embryons Pax3Pax3-En-IRESnlacZ/+ qui permet d'étudier le rôle de Pax3 dans le somite hypaxial et ses dérivés, sans qu'il y ait de mort cellulaire prononcée, ainsi que notre analyse des séquences qui régulent l'expression de Myf5, suggèrent que Pax3 active directement Myf5 dans ce domaine de myogenèse.

Nous étudions également la régulation d'expression de Myf5 dans le muscle adulte, ainsi que sa transcription inattendue dans le système nerveux central.

Nous recherchons les cibles de Pax3 dans les cellules progénitrices du muscle présentes dans les bourgeons des membres, ainsi que les co-facteurs qui interagissent avec Pax3.

Blimp1 et myogenèse

[S. Vincent]

Blimp1 joue un rôle définitif dans l'émergence du lignage de cellules musculaires lentes chez l'embryon du poisson zèbre. Blimp1 est également exprimé dans le myotome de la souris où nous étudions sa fonction.

Les cellules du muscle lisse de l'aorte dorsale dérivent des mêmes cellules progénitrices que le muscle de squelette du myotome

[M. Esner, F. Relaix, D. Rocancourt, en collaboration avec J.-F. Nicolas (IP) et G. Cossu (Milan)]

Par une analyse clonale rétrospective, nous avons démontré que les cellules de l'aorte dorsale et du myotome sont dérivées de la même cellule progénitrice. Différentes classes de clones reflètent le moment pendant le développement embryonnaire quand cet événement a lieu. En particulier les clones présents dans le myotome hypaxial d'un seul somite et dans l'aorte dorsale au même niveau axial, suggèrent une origine somitique récente (Figure 1A). Cette proposition est renforcée par les observations sur les embryons Pax3GFP/+. La proteine Pax3 n'est présente que dans le dermomyotome et dans les cellules progénitrices qui ont quitté cette structure. Le GFP par contre est détecté, en plus, dans les cellules situées entre le somite et l'aorte ainsi que dans toutes les cellules du muscle lisse de l'aorte (Figure 1B,C). Il ne s'agit pas de cellules de la crête neurale et nous concluons donc que le muscle lisse de l'aorte dorsale est dérivé des cellules progénitrices qui avaient exprimé Pax3 dans les somites/mésoderme présomitique. Ces résultats ont des implications pour l'origine des mésoangioblastes, cellules souches mésodermales, présentes dans l'aorte, qui ont le potentiel de former les cellules du muscle lisse et du muscle de squelette.

Cardiogenèse. Le deuxième champ cardiaque

[F. Bajolle, D. Galli, E. Pecnard, S. Zaffran, Y. Watanabe, en collaboration avec N. Brown (Londres), R. Kelly (Marseille) et S. Meilhac (Cambridge)]

Nous avons démontré, par analyse clonale rétrospective, que deux lignages de cellules participent à la formation du myocarde chez l'embryon de la souris. Leurs contributions se distinguent par l'absence de cellules du deuxième lignage dans le ventricule gauche, tandis que la voie efférente du cœur est formée uniquement à partir du deuxième lignage. Ceci est en accord avec la présence de deux champs cardiaques, identifiés par les expériences d'explants et de marquage par le Di-I. Le deuxième champ cardiaque est caractérisé par l'expression d'un réseau de gènes dont les mutations donnent les phénotypes attendus d'une atteinte à la contribution du deuxième lignage.

Nous nous intéressons actuellement à la partie postérieure du deuxième champ cardiaque et à sa contribution au pôle veineux du cœur. Nous étudions l'acquisition d'une identité droite ou gauche des cellules qui contribuent au myocarde des deux oreillettes. En ce qui concerne la partie antérieure du deuxième champ, nous étudions le rôle de la voie de signalisation Fgf dans cette sous-région qui est caractérisée par l'expression de Fgf8 et Fgf10. Les embryons Fgf10-/- n'ont pas un phénotype cardiaque précoce, probablement dû à la présence de Fgf8. Par contre en l'absence du récepteur de Fgf10, Fgfr2-IIIb, il y a un phénotype cardiaque plus prononcé avec une légère hypoplasie du ventricule droit. Actuellement, nous construisons les doubles mutants Fgf8-/-/Fgf10-/-, avec la perte de fonction de Fgf8 ciblé au deuxième champ cardiaque qui devrait donner un phénotype plus prononcé de la voie efférente et du ventricule droit.

La morphogenèse de la voie efférente du coeur

[F. Bajolle, E. Pecnard, S. Zaffran, en collaboration avec D. Bonnet (Hôpital Necker) et R. Kelly (Marseille)]

Nous avons effectué une analyse de la morphogenèse de la voie efférente. Les lignées transgéniques qui marquent les sous-régions du myocarde de cette partie du cœur destinées à contribuer à la base de l'aorte et du tronc pulmonaire respectivement, nous ont permis de mettre en évidence une rotation du myocarde. Ce phénomène a été confirmé par le suivi de cellules marquées par le Di-I. Chez les embryons avec des mutations qui affectent la contribution de la crête neurale (Pax3-/-) ou la signalisation droite/gauche (Pitx2-/-), nous constatons un arrêt de rotation avec des malformations du positionnement des grandes artères. Cette observation suggère d'une part que la rotation du myocarde est influencée par ces deux contributions et d'autre part qu'elle est importante pour la morphogenèse de la voie efférente du cœur.

Légendes des photos :

Figure 1 : L'origine somitique des cellules de l'aorte dorsale. A. Les cellules β-galactosidase positives, de même origine clonale, dans le muscle squelettique du myotome hypaxial (HM) et dans le muscle lisse de l'aorte dorsale (DA). Le muscle est marqué par un anticorps anti-actine (rouge). B. Les cellules Pax3-GFP positives (vertes) dans le dermomyotome (DM) du somite et dans la région entre le somite et l'aorte dorsale (DA). C. Chez un embryon Pax3GFP/GFP, les cellules du muscle lisse de l'aorte dorsale (DA) sont GF positives (vertes).

Mots-clés: Myogenèse, Pax3, Pax7, Myf5, Aorte dorsale, Cardiogenèse, Fgfs



  site web

puce Plus d' informations sur notre site web


  publications

puce Toutes les publications 2005 sur notre base de données


  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  TAISNE Myriam mtaisn@pasteur.fr DAUBAS Philippe, CNRS (CR1) pdaubas@pasteur.fr

MONTARRAS Didier, Chef de labo (IP) dmontarr@pasteur.fr

RELAIX Frédéric, INSERM (CR1) frelaix@pasteur.fr

VINCENT Stéphane, INSERM (CR2) svincent@pasteur.fr

BAJARD Lola (étudiante en thèse) lbajard@pasteur.fr

BAJOLLE Fanny (étudiante en thèse) fbajolle@pasteur.fr

CRIST Colin (postdoc) cgcrist@pasteur.fr

ESNER Milan (postdoc) esner@pasteur.fr

LAGHA Mounia (étudiante en thèse) mounia@pasteur.fr

WATANABE Yusuke (postdoc) yusuke@pasteur.fr

BODIN Catherine (technicienne IP) cbodin@pasteur.fr

MARCHISET Sophie (aide de laboratoire IP) smarchou@pasteur.fr

PECNARD Emmanuel (technicien CNRS) pecnard@pasteur.fr

PERREAU Jacqueline (ingénieur CNRS) jperreau@pasteur.fr

ROCANCOURT Didier (technicien IP) drocanco@pasteur.fr


Rapports d'activité 2005 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr