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     Génétique moléculaire des Bunyaviridés


  Responsable : Bouloy Michèle (mbouloy@pasteur.fr)


  resume

 

L'activité principale de l'Unité porte sur l'étude du virus de la fièvre de la vallée du Rift (VFVR), un arbovirus qui représente un modèle de fièvre hémorragique virale. Nous cherchons à comprendre les mécanismes impliqués dans la pathogenèse chez le mammifère en identifiant le(s) facteur(s) de virulence et leurs partenaires cellulaires. L'infection du moustique ou de lignées de cellules de moustiques par le VFVR semble asymptomatique. L'étude des bases moléculaires des effets de l'infection dans ces deux hôtes constitue un axe de recherche complémentaire. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de produire un vaccin ou des molécules à visée thérapeutique.

Un autre aspect des activités de l'unité consiste à produire des antigènes recombinants utilisés par les laboratoires de référence et les Instituts Pasteur du Réseau International pour le diagnostic de virus hautement pathogènes ou difficiles à produire en cultures cellulaires.



  rapport

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le rôle de l'interféron et de la protéine NSs dans la pathogenèse

Le virus de la fièvre de la vallée du Rift est un arbovirus de la famille des Bunyaviridae (genre Phlebovirus) transmis par les moustiques. Il est endémique en Afrique sub-tropicale où il provoque de nombreuses épizooties et épidémies. Récemment, il s'est propagé au Moyen-Orient. Les ruminants sont très sensibles, les jeunes meurent dans de très brefs délais, les femelles avortent ou donnent naissance à des fœtus mal-formés. Chez l'homme, l'infection peut conduire à une forme hémorragique mortelle avec hépatite aiguë. La fonction de la protéine non structurale NSs est restée longtemps ignorée. Cette protéine phosphorylée forme des filaments nucléaires (Fig 1) alors que tout le cycle viral se déroule dans le cytoplasme. L'étude de cette protéine constitue l'axe principal de nos recherches. L'analyse génétique du mutant avirulent Clone 13 dont la protéine NSs est délétée de 70%, a permis de mettre en évidence le rôle majeur de NSs dans la virulence et de montrer que NSs bloque la réponse antivirale de l'hôte en empêchant la production d'interféron de type I. L'analyse du mécanisme utilisé par NSs pour assurer cette fonction antagoniste de la production d'interféron indique que NSs est en réalité, un inhibiteur général de la transcription cellulaire qui interagit avec p44 une des sous unités du facteur général de transcription TFIIH. En séquestrant p44 et XPB, une autre sous unité de TFIIH dans le filament nucléaire, la concentration cellulaire en TFIIH s'appauvrit et la cellule n'a plus la capacité de transcrire ses ARN. D'autres partenaires cellulaires sont en cours d'étude.

l'étude de la transcription et réplication à l'aide de minigénomes

Afin de développer un système de génétique inverse, nous avons établi un système de transcription où les protéines et les ARN viraux sont exprimés à partir de plasmides. Ce système a été testé à l'aide d'un mini-génome ou ARN pseudo-viral, porteur des séquences non codantes de l'un des trois segments génomiques L, M et S et du gène rapporteur de la chloramphénicol acétyle transférase en orientation antisens. Ces mini-génomes sont synthétisés à partir de plasmides sous le contrôle du promoteur de l'ARN polymérase I cellulaire. Nous avons construit les plasmides permettant la synthèse des mini-génomes L-CAT, M-CAT et S-CAT et avons montré que ces derniers sont transcrits efficacement par le complexe viral formé de la polymérase L et de la nucléocapside N.

L'infection du moustique

La réalisation du cycle biologique du VFVR nécessite l'intervention d'un hôte invertébré vecteur (le moustique) et un hôte vertébré (animal ou homme). Les facteurs d'émergence de la FVR sont encore mal définis mais néanmoins, ils sont sans aucun doute intimement liés à l'écologie des différents hôtes. Parce que les moustiques sont tributaires de la présence de sites en eau, la dynamique de leurs populations ainsi que leur structure génétique évoluent selon les régions géographiques et les saisons. Les moustiques vecteurs du VFVR sont nombreux mais on en distingue deux principaux : Aedes vexans d'écologie selvatique intervenant préférentiellement dans un cycle enzootique et Culex pipiens d'écologie urbaine ayant joué un rôle majeur dans les épidémies d'Egypte. Nous cherchons à déterminer quelle est l'aptitude du vecteur à transmettre le virus et comment le système vectoriel évolue dans un environnement donné. Notre approche consiste à mesurer le niveau de réceptivité des moustiques aux différentes souches virales et à suivre les vecteurs par des analyses de génétique de populations. Ainsi, nous avons mis au point un système d'infection expérimentale pour mesurer la compétence vectorielle et avons développé des marqueurs de suivi des populations, les microsatellites. Ces travaux sont réalisés en collaboration avec différents Instituts Pasteur du Réseau International.

Production d'antigène recombinant pour le diagnostic sérologique

Certains bunyavirus se répliquent mal dans les cultures cellulaires (hantavirus) ou pour d'autres virus, leur manipulation nécessite un laboratoire de haute sécurité (fièvre hémorragique de Crimée-Congo), ce qui rend difficile la préparation d'antigènes viraux utilisables pour le diagnostic sérologique. Lors d'infection par les Bunyavirus, la nucléoprotéine N est l'antigène principal et induit une forte réponse humorale. Nous avons mis au point un test de détection d'anticorps par ELISA en utilisant une forme recombinante de la nucléoprotéine de l'hantavirus Puumala. Cet antigène est exprimé par le réplicon du virus de la forêt de Semliki ; il permet de diagnostiquer cette fièvre hémorragique non mortelle qui circule dans le Nord et l'Est de la France et de détecter les infections virales chez le campagnol roussâtre qui en est le réservoir.

Fig 1. Le filament nucléaire formé de la protéine NSs dans une cellule infectée par le virus de la fièvre de la vallée du Rift

Mots-clés: virus de la fièvre de la vallée du Rift, fièvre hémorragique, arbovirus, zoonose, hantavirus, pathogenèse



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  MILLIOT Brigitte, bmilliot@pasteur.fr BILLECOCQ Agnès, Chargée de recherche, Institut Pasteur, abilleco@pasteur.fr

FAILLOUX-MANUELLAN Anna-Bella, Chargée de recherche, Institut Pasteur, afaillou@pasteur.fr

GAULIARD Nicolas, Doctorant, boursier de la Fondation Odette et Jean Duranton de Magny

LEGER Psylvia, Doctorante, boursière du MRT

MOUTAILLER Sara, Doctorante, boursière de la Fondation de France

LARA Estelle, Master 2ème année

KUNTZELMAN Elise, Master 2ème année

COUDRIER Daniel, Technicien supérieur, coudrier@pasteur.fr

TAMIETTI Carole, Aide de laboratoire, tamietti@pasteur.fr


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