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     Génétique Moléculaire - CNRS URA 2172


  Responsable : Pugsley, Anthony P (max@pasteur.fr)


  resume

 

L'unité de Génétique moléculaire étudie des aspects fondamentaux de l'expression génique et du ciblage et d'assemblage de protéines de l'enveloppe chez les bactéries, principalement chez Escherichia coli. Une multitude d'approches de biologie moléculaire, biologie cellulaire, biochimie, biophysique et biologie structurale est employée afin d'obtenir des informations précises sur la structure et la dynamique de composants cellulaires impliqués dans ces processus.



  rapport

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Escherichia coli est un excellent organisme modèle pour l'étude de processus biologiques fondamentaux. Nous continuons à exploiter ses nombreux avantages pour améliorer nos connaissances du trafic de protéines ainsi que de la perception et de la traduction de signaux dans les circuits de régulation génétique. Les résultats que nous avons obtenus sont d'un intérêt général qui dépasse très largement les frontières de la bactériologie classique.

Une grande partie de nos travaux concerne le système de sécrétion de type II, présent chez la plupart des bactéries à Gram-négatif. La sécrétion par ce système se fait en deux étapes distinctes : la translocation des exoprotéines à travers la membrane interne (généralement par la machinerie Sec) suivie de leur repliement, puis le transport de l'exoprotéine à travers la membrane externe par une machinerie composée de 12 protéines spécifiques. Les éléments clefs de cette machinerie incluent une protéine dodécamérique (la sécrétine) qui forme un canal dans la membrane externe, un chaperone (la pilotine) nécessaire à l'insertion de ce complexe dans la membrane externe, un piston dynamique (le pseudopilus) qui, selon les modèles actuels, pousse les exoprotéines à travers le canal formé par la sécrétine, et un moteur qui fournit de l'énergie au système.

Selon sa structure, que nous venons de déterminer par la microscopie électronique, une grande partie de la sécrétine est exposée à la face périplasmique de la membrane externe. La protéolyse par la trypsine élimine plus de la moitié de cette partie de la protéine ; la partie qui résiste à la trypsine maintient sa forme dodécamérique et se comporte comme une unité indépendante capable de se multimériser. En association avec la pilotine, ce domaine C-terminal s'associe avec la membrane interne. Dans la suite de nos études, nous proposons de déterminer la structure de ce domaine, ainsi que du domaine N-terminal et de la pilotine complexée au domaine de la sécrétine auquel elle se fixe. Nous étudions aussi le rôle d'autres composants cellulaires nécessaires à l'assemblage du complexe sécrétine, la chronologie des interactions intra-et intermoléculaires de la sécrétine et la pilotine et leur insertion dans la membrane externe in vivo et in vitro.

Nous avons déjà déterminé la structure du composant majeur du pseudopilus. Cette structure ne contenait pas les 25 premiers acides aminés pourtant nécessaires à son exportation, son association avec la membrane interne (où réside le pool de sous-unités non assemblées), et son assemblage en pseudopilus. Nous étudions le rôle exact de cette partie de la protéine dans ces processus et sa voie d'exportation.

Dans une autre partie de notre travail sur le système de sécrétion de type II, nous avons utilisé la microscopie à fluorescence pour déterminer la localisation de composants du moteur sur lesquels nous avons greffé une protéine fluorescente sans affecter sa capacité à promouvoir la sécrétion. Nos résultats suggèrent que ce moteur est dispersé en différents endroits de la membrane interne. Une approche similaire nous a permis de localiser la région d'une exoprotéine qui est nécessaire à sa reconnaissance par la machinerie de sécrétion. Dans un autre projet, la même approche nous a permis de déterminer, in situ, dans laquelle des deux membranes sont localisées une classe particulière de protéines exportées, les lipoprotéines. Cette approche, plus simple et plus directe que les approches biochimiques jusqu'alors utilisées, doit faciliter nos futures études des mécanismes de localisation des lipoprotéines dans les bactéries.

La modification post traductionnelle des lipoprotéines implique trois enzymes. Toutes les trois sont essentielles à la viabilité bactérienne. Nous nous focalisons sur une de ces enzymes, l'apolipoprotéine-N-acyl transférase. Après avoir documenté les effets cellulaires qui résultent de son inactivation ou élimination, nous étudions son activité enzymatique avec, comme objectifs, la mise au point d'un système de criblage et l'obtention de données structurales qui doivent nous permettre d'identifier des inhibiteurs capables de tuer les bactéries à Gram-négatif.

Nos études sur la transduction de signal ont pour origine notre vieil intérêt pour le système maltose d'E. coli. Le régulateur central du régulon maltose est la protéine MalT, un activateur transcriptionnel qui se trouve être le prototype d'une nouvelle classe d'ATPases signalisatrices, les protéines STAND (signal transduction ATPases with numerous domains). Ces protéines, ubiquitaires, sont des plates-formes de signalisation qui intègrent des signaux régulateurs et qui, en réponse, renvoient un signal ou exécutent une fonction. A cause de leur complexité structurale, rares sont les protéines STAND qui sont étudiées in vitro, ce qui fait que les mécanismes moléculaires qui gouvernent ces processus de transduction de signal sont mal compris. La protéine MalT est en équilibre entre une forme monomérique, inactive et une forme multimérique, transcriptionnellement active, cet équilibre étant contrôlé par trois effecteurs négatifs (les protéines MalK, MalY et Aes) et par un effecteur positif, le maltotriose. Les trois domaines N-terminaux de MalT : DT1 (domaine ATPase) et DT2 - tous deux caractéristiques des protéines STAND, - et DT3, le domaine senseur, forment un module de transduction de signal qui répond aux signaux régulateurs via un changement de sa structure quaternaire et qui, ce faisant, détermine l'aptitude de DT4, le domaine de fixation à l'ADN, à se fixer sur les promoteurs cibles. Nos objectifs sont de déterminer (a) les mécanismes par lesquels MalT répond à ces signaux positifs et négatifs, ainsi que (b) le rôle de l'activité ATPase de MalT dans le fonctionnement de la protéine.

Légendes des photos :

Photo 1 : Structure de la sécrétine PulD analysée par cryomicroscopie électronique

Photo 2 : Localisation par microscopie à fluorescence d'un composant du moteur de la machinerie de sécrétion de type II greffée à une protéine fluorescente

Mots-clés: sécrétion, canaux, membrane externe, transduction de signaux, transcription



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Lavenir, Armelle (alavenir@pasteur.fr) Bayan, Nicolas, Université de Paris XI, (Professeur, nbayan@pasteur.fr)

Danot, Olivier, Institut Pasteur, (Chargé de Recherche, olivdano@pasteur.fr)

Francetic, Olivera, Institut Pasteur, (Chargé de Recherche, ofrancet@pasteur.fr)

Richet, Evelyne, CNRS, (DRII, erichet@pasteur.fr)

Buddelmeijer, Nienke, Postdoc

Lewenza, Shawn, Postdoc

Marquenet, Emélie, Thésard

Collin Séverine, Master II

Guilvout, Ingrid, (Ingénieur, ingvout@pasteur.fr)

Nadeau, Nathalie, (Technicienne, nnadeau@pasteur.fr)

Reyngoud, Maria, (Agent de laboratoire)

Vidal-Ingigliardi, Dominique, (Ingénieur, dvidalin@pasteur.fr)


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