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     Génétique Mycobactérienne


  Responsable : GICQUEL Brigitte (bgicquel@pasteur.fr)


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Causée par les mycobactéries du complexe tuberculosis, la tuberculose continue de poser un problème majeur de santé publique : elle est responsable d'environ deux millions de morts par an. Le BCG, seul vaccin disponible actuellement contre cette maladie, est d'une efficacité relative. Quant à l'utilisation des antibiotiques, elle se heurte à l'apparition de souches résistantes. Dans ce contexte, l'Unité de Génétique Mycobactérienne s'intéresse à la caractérisation des facteurs de virulence de Mycobacterium tuberculosis et aux réponses immunitaires induites par cette bactérie et le BCG. Ces études pourraient conduire à l'identification de cibles thérapeutiques pour de nouveaux agents antituberculeux, et de composants de la bactérie susceptibles d'entrer dans la composition de nouveaux vaccins, voire d'une souche atténuée plus efficace que le BCG. Enfin, en collaboration avec d'autres équipes l'Unité participe à l'identification de marqueurs génétiques de l'hôte associés à la susceptibilité à la tuberculose et met en évidence des marqueurs génétiques spécifiques de souches de M. tuberculosis particulièrement épidémiques, en particulier celles qui sont responsables d'épidémies de tuberculose à bacilles multirésistants.



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Etude génétique des déterminants de la virulence (M. Jackson, O. Neyrolles, B. Gicquel)

L'utilisation d'un vecteur thermosensible dérivé du plasmide de Mycobacterium fortuitum pAL5000 et contenant le marqueur de contre-sélection sacB (vecteur Ts/sacB) a permis de construire et d'isoler des mutants d'échange allélique et de transposition chez les mycobactéries du complexe de M. tuberculosis. Grâce à l'outil Ts/sacB, une banque ordonnée de 4000 mutants a été obtenue par la technique de mutagénèse par transposition étiquetée ou "STM" ("signature-tagged transposon mutagenesis"), et criblée pour rechercher directement chez la souris ou dans les macrophages en culture des souches atténuées pour la virulence. Environ 4000 souches ont maintenant été criblées pour leur capacité à se multiplier dans les poumons de souris durant la phase aigue de l'infection. 31 mutants atténués au total ont été sélectionnés et les mutations qu'ils portent ont été caractérisées.

Dix des insertions de transposon retrouvés chez les mutants atténués dans les macrophages ou chez la souris sont localisées dans une région du génome impliquée dans la biosynthèse et le transport de lipides complexes de l'enveloppe de M. tuberculosis : les dimycocérosates de phthiocérol (DIM) et les phénolglycolipides (PGL). Plusieurs de ces gènes ont été caractérisés d'un point de vue fonctionnel au laboratoire. Récemment, nous avons ainsi pu montrer que le gène lppX code une lipoprotéine qui est impliquée dans le transport des DIM à la surface de M. tuberculosis. La résolution de la structure tri-dimensionnelle de la protéine LppX (en collaboration avec l'équipe du Dr. Y. Bourne au CNRS à Marseille) a révélé des similarités structurales entre LppX et les protéines LolA et LolB qui, chez les bactéries à Gram négatifs, transportent des lipoprotéines depuis le périplasme jusque dans la membrane externe (Sulzenbacher et al., EMBO J, 2006). Ces travaux décrivent le tout premier mécanisme de transport de lipides à la surface de M. tuberculosis. Ils soulignent en outre le rôle important que jouent les lipoprotéines dans la construction de l'enveloppe mycobactérienne.

D'autres mutants de transposition présentant des déficiences dans la synthèse de la partie phénolique et saccharidique des PGL ont été caractérisés d'un point de vue biochimique et leur pathogénicité est actuellement à l'étude dans des macrophages en culture et dans un modèle d'infection murin.

Parallèlement à ces travaux, nous avons entrepris d'étudier le système de régulation à deux composants PhoP/PhoR de M. tuberculosis. Ce système présente des similarités de séquence avec le système PhoP/PhoQ de Salmonella, connu pour réguler plus de 40 gènes dont plusieurs déterminants de la virulence de cette bactérie. En collaboration avec l'équipe du Pr. Carlos Martín (Faculté de Médecine de Saragosse, Espagne), nous avons montré que PhoP/PhoR joue un rôle important dans la virulence de M. tuberculosis. Afin de déterminer les raisons de l'atténuation de la virulence du mutant phoP de M. tuberculosis et de caractériser ainsi de nouveaux gènes de virulence de cette bactérie, nous avons entrepris d'identifier les gènes dont l'expression est régulée par PhoP/PhoR. En raison des particularités morphologiques que présente le mutant phoP de M. tuberculosis, nous avons comparé dans un premier temps la composition de son enveloppe à celle de la souche de type sauvage. Les résultats montrent que l'inactivation de phoP ou de phoP-phoR dans différentes souches de M. tuberculosis inhibe totalement la synthèse de plusieurs lipides dérivés de polykétides connus pour être restreints aux espèces pathogènes de mycobactéries : les sulfolipides, les di-acyltréhaloses et les poly-acyltréhaloses (Asensio et al., J. Biol. Chem, 2006). L'intérêt vaccinal des souches atténuées de M. tuberculosis est étudié dans le cadre de "TB-VAC" de la Commission Européenne.

Interactions entre M. tuberculosis et les phagocytes (O. Neyrolles, M. Jackson, B. Gicquel)

Afin de mieux comprendre les mécanismes du parasitisme des macrophages par M. tuberculosis, de nouvelles approches combinées de biologie cellulaire et de génomique fonctionnelle sont en cours de développement au laboratoire. Le criblage par STM a également été utilisé afin d'identifier des gènes de M. tuberculosis impliqués dans la capacité de la bactérie à parasiter les macrophages humains. 21 mutants atténués ont été isolés et les gènes mutés caractérisés. Les produits de ces gènes, dont un grand nombre codent pour des composants de l'enveloppe mycobactérienne, sont en cours d'étude.

Par ailleurs, nous étudions également les intéractions précoces entre les mycobactéries et les phagocytes humains. Nous avons ainsi montré récemment que M. tuberculosis, comme d'autres bactéries du complexe Tuberculosis, utilise la lectine DC-SIGN pour entrer dans les cellules dendritiques humaines, et que le lipoarabinomannane (LAM), un lipoglycane abondant de la paroi mycobactérienne, est un ligand de DC-SIGN. Nous avons également montré que DC-SIGN est exprimé sur les cellules dendritiques pulmonaires humaines et nous avons pu détecter des antigènes mycobactériens dans des cellules dendritiques exprimant DC-SIGN dans des ganglions de patients tuberculeux, indiquant que les mycobactéries intéragissent probablement avec la lectine in vivo. Par ailleurs, nous avons caractérisé les déterminants moléculaires de l'intéraction entre M. tuberculosis et DC-SIGN et nous avons pu ainsi expliquer pourquoi DC-SIGN ne reconnaît que les mycobactéries du complexe Tuberculosis. Ce résultat indique que ces pathogènes ont probablement évolué récemment pour utiliser cette lectine. Une étude conduite au laboratoire a montré que la spécificité de DC-SIGN Pour les bactéries du complexe Tuberculosis repose probablement sur l'utilisation de plusieurs ligands de l'enveloppe mycobactérienne par la lectine. (photo 1)

De plus, une collaboration avec les Hôpitaux Saint-Louis et Necker à Paris a permis de mettre en évidence que l'expression de DC-SIGN est rapidement induite dans les macrophages alvéolaires après infection par M. tuberculosis. Chez les patients tuberculeux, jusqu'à 70% des macrophages alvéolaires expriment la lectine à leur surface, alors que cette expression est très faible dans des macrophages alvéolaires de patients avec d'autres pathologies pulmonaires ou de sujets contrôles (Tailleux et al., PloS Medicine, 2006). Nous avons montré que les macrophages alvéolaires exprimant DC-SIGN constituent une cible préférentielle pour le bacille au cours de l'infection. Les conséquences fonctionnelles de l'expression de DC-SIGN dans ces cellules sont en cours d'étude. Une étude cas-contrôle chez des patients tuberculeux et des sujets contacts, à laquelle notre équipe a participé, a de plus montré qu'un variant génétique du gène codant pour DC-SIGN est fortement associé à la protection contre le développement de la tuberculose, résultat soulignant encore l'importance de ce récepteur au cours de la maladie (Barreiro et al., PloS Medicine, 2006).

Recherche de nouvelles cibles pour des médicaments anti-tuberculeux (M. Jackson, B. Gicquel)

Le phosphatidylinositol (PI) et les produits qui en sont métaboliquement dérivés comme les phosphatidylinositol mannosides (PIM), le lipomannane (LM) et le lipoarabinomannane (LAM) sont des phospholipides/ lipoglycanes qui jouent un rôle important, tant dans la physiologie des mycobactéries que dans leurs intéractions avec l'hôte. La caractérisation des enzymes impliquées dans leur biosynthèse, en plus d'apporter des connaissances fondamentales sur la façon dont sont synthétisées ces molécules, pourrait permettre d'identifier des cibles pour le développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux.

Nous avons identifié chez M. tuberculosis un groupe de cinq gènes potentiellement impliqués dans les étapes précoces de la synthèse des PIM. Les fonctions de deux de ces gènes, pimA (Rv2610c) et Rv2611c ont été analysées et nous avons pu montrer qu'ils codent respectivement une mannosyltransférase et une acyltransférase impliquées dans la synthèse des phosphatidylinositol mono-mannosides di- et tri-acylés. PimA est apparue comme étant une enzyme essentielle et constitue donc une cible intéressante pour le développement de nouveaux médicaments anti-tuberculeux. La structure tri-dimensionnelle de PimA a récemment été résolue dans l'Unité de Biochimie Structurale de l'Institut Pasteur. La connaissance de cette structure va permettre le criblage virtuel (in silico) d'inhibiteurs de cette enzyme dont l'efficacité sera ensuite testée au laboratoire en utilisant les essais enzymatiques in vitro que nous avons développés pour PimA.

Dans une approche plus générale et afin d'identifier d'autres enzymes de M. tuberculosis impliquées dans la biosynthèse des PIM, LM et LAM, nous avons entrepris d'inactiver par recombinaison homologue plusieurs autres gènes codant des glycosyltransférases potentiellement impliquées dans la biosynthèse de ces molécules.

Une autre de nos activités dans le cadre de la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques concerne l'étude du mode d'action de l'Isoxyl, un agent anti-tuberculeux qui était utilisé dans le traitement clinique de la tuberculose dans les années 1960. L'isoxyl est un inhibiteur de la synthèse de l'acide oléique et des acides mycoliques chez les mycobactéries.

BCG et nouveaux vaccins (N. Winter)

Mycobacterum bovis BCG est le seul vaccin prophylactique disponible pour protéger contre la tuberculose avec une efficacité variable. Bien que le BCG soit très largement utilisé, les mécanismes immunitaires de cette vaccination sont mal caractérisés. En particulier, les événements de l'immunité innée qui jouent un rôle décisif sur la mise en place de la réponse protectrice sont mal connus. Nous avons décidé d'étudier ces événements précoces chez la souris inoculée dans le derme auriculaire afin de mimer la vaccination intradermique employée chez l'homme. A l'aide de souches de rBCG fluorescentes, nous avons caractérisé les cellules hôte du bacille dans le derme et le ganglion auriculaire drainant pendant 3 jours après la vaccination. Les cellules résidentes de la peau, incluant les cellules dendritiques (DC) et les macrophages ne sont pas majoritairement impliquées dans la capture des bacilles. Dans la peau comme dans le ganglion drainant, les cellules hôte des bacilles dans ces temps très précoces sont des neutrophiles. Après injection de deux souches de rBCG fluoresçant dans le rouge ou le vert, des neutrophiles abritant distinctement des bacilles verts ou rouges sont observés dans la capsule du ganglion drainant indiquant que ces neutrophiles portant des bacilles ont quitté la périphérie. En effet, de façon surprenante, nous avons observé par microscopie confocale, des neutrophiles infectés dans la lumière de vaisseaux lymphatiques du derme auriculaire . Ainsi, nous montrons que les neutrophiles, comme les cellules dendritiques ou les monocytes inflammatoires, peuvent quitter le tissu pour migrer par voie lymphatique vers l'organe lymphoide (Abadie et al., Blood, 2005). Dans le ganglion, les neutrophiles proches de cellules dendritiques et de lymphocytes T ont été observés, ce qui suggère que les neutrophiles pourraient jouer un rôle dans la présentation de l'antigène. C'est la question que nous essayons de résoudre actuellement. Nous étudions les mécanismes moléculaires permettant aux neutrophiles activés de quitter le site inflammatoire pour migrer vers l'organe lymphoïde.

Par le passé, nous avons observé que les DC étaient également hôte pour le BCG in vivo. Donc, nous nous intéressons à élucider les mécanismes permettant aux DC directement infectées de présenter les antigènes dérivés du BCG aux lymphocytes T naïfs. Nous détaillons en particulier comment la signalisation via les récepteurs de type Toll 2 et 4 influe sur les différentes voies de présentation employées par les DC pour apprêter les antigènes et les présenter en association avec les molécules de classe I et II.(photo 2)

Le BCG est également un outil intéressant pour le développement de vaccins vivants recombinants. L'intégration des gènes d'intérêt dans un site défini du chromosome de BCG permet d'obtenir des souches génétiquement stables in vivo. Nous avons récemment observé que les vecteurs intégratifs dérivés du mycobactériophage Ms6 s'inséraient dans le chromosome du BCG, dans un gène codant un ARN de transfert pour l'alanine, le gène tRNAalaV. Or, le chromosome de BCG contient deux autres gènes tRNAalaU et tRNAalaT dont la partie 3' contient une séquence très similaire au site d'attachement attP de Ms6 permettant l'insertion. Par mutagénèse dirigée, nous avons modifié la séquence attP de vecteurs dérivés de Ms6 afin de leur permettre de s'intégrer dans tRNAalaU et tRNAalaT. Ainsi, nous avons construit une souche rBCG ayant inséré deux vecteurs dérivés de Ms6, l'un au locus tRNAalaV et l'autre au locus tRNAalaU. Ceci permettra d'obtenir des souches de BCG exprimant plusieurs gènes hétérologues, dans le but de développer des multivaccins.

Epidémiologie moléculaire de la tuberculose (Responsable : Brigitte Gicquel)

Des marqueurs spécifiques de souches de M. tuberculosis davantage transmissibles et responsables d'épidémies, en particulier d'épidémies de tuberculose à bacilles multirésistants aux antibiotiques ont été recherchés en collaboration avec les équipes du réseau européen d'épidémiologie moléculaire de la tuberculose, le Public Health Research Institute et les Instituts du réseau et Instituts associés. Des allèles particuliers de gènes impliqués dans la réparation de l'ADN ont été identifiés chez plusieurs familles de souches, en particulier chez les isolats multirésistants aux antibiotiques. Ces résultats suggèrent que ces souches particulièrement adaptées à l'hôte ont évolué grâce à l'acquisition de mutations dans des gènes de réparation de l'ADN qui ont conduit à des phénotypes mutateurs vraisemblablement transitoires. Des allèles spécifiques des souches W-Beijing peuvent être utilisés pour la mise au point de diagnostics moléculaires identifiant les différentes branches de la famille W. Beijing. Il s'agit d'allèles de gènes de la famille mutT et de ogt. Les quatre gènes annotés mutT de M. tuberculosis et M. smegmatis ont été étudiés. Le gène muT1 est antimutateur chez M. smegmatis et M. tuberculosis. Par contre le gène mutT4 ne s'est avéré être un gène antimutateur que chez M. smegmatis (Dos Vultos et al., J. bacteriol, 2006). Le typage moléculaire des souches du complexe tuberculosis est effectué dans plusieurs régions pour définir les types majeurs et étudier leurs transmissions. Des marqueurs spécifiques de génotypes majeurs sont recherchés par séquençage d'une série de gènes, en particulier les gènes impliqués dans la réparation de l'ADN. Cette approche permet d'identifier des gènes antimutateurs mais aussi de définir des polymorphismes qui sont ensuite détectés par génotypage.

Légendes des photos :

Photo 1 : Expression de DC-SIGN à la surface d'une cellule

Photo 2 : DC dérivées de moelle osseuse de souris infectées par une souche de rBCG exprimant le gène codant la Green Fluorescent Protein. Les molécules de la chaîne invariante H2M (rouge) se concentrent dans les vacuoles à BCG (vert) alors que les molécules de classe II (bleu) se disposent en surface de la cellule signalant sa maturation. (Photographie de microscopie confocale, par le Dr Eric Prina)

Mots-clés: Mycobactérie, pathogénicité, virulence, tuberculose, epidémiologie, vaccin



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