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     Biodiversité des Bactéries pathogènes émergentes - U389 INSERM


  Responsable : GRIMONT Patrick (pgrimont@pasteur.fr)


  resume

 

L'Unité comprend des laboratoires de recherche, un Centre Collaborateur OMS, trois Centres Nationaux de Référence (CNR) et un Centre fournissant des services d'identification bactérienne dans les domaines clinique, vétérinaire et industriel. Tous les aspects de la taxonomie bactérienne sont développés en ayant pour objectif d'apporter une meilleure définition moléculaire et physiologique des espèces et de réaliser des outils nouveaux d'identification et de typage moléculaires. Nos méthodes sont appliquées à toutes sortes de bactéries, y compris des pathogènes émergents.



  rapport

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Taxonomie moléculaire (Patrick Grimont, Francine Grimont)

Le séquençage du gène rrs, les hybridations ADN-ADN quantitatives et la ribotypie nous ont permis d'individualiser deux nouvelles espèces d'Arthrobacter, A. bergerei et A. arilaitensis, habitant à la surface de

La phylogénie des Pseudomonas a été approchée par séquençage du gène rpoB. La résolution taxonomique obtenue était trois fois plus élevée que celle obtenue par le gène rrs. L'identification des espèces de Pseudomonas par séquençage du gène rpoB est maintenant possible (thèse de Lineda Ait Tayeb). Cette approche a été étendue au genre Proteus (collaboration avec G. Giammanco et S. Pignato).

L'étude des flores complexes est abordée par clonage et séquençage du gène rrs, hybridation in situ en fluorescence (FISH) et par TTGE (Temporal Temperature Gradient gel Electrophoresis) dans le cadre de divers contrats (Katiana Saunier, Christophe Brézillon) (figure 1).

Génétique évolutive et identification des pathogènes du genre Klebsiella (Sylvain Brisse, Cindy Fevre, Patrick Grimont).

L'étude de la diversité phylogénétique des Klebsiella, pathogènes opportunistes, a permis de démontrer la diversité et l'ancienneté, depuis des millions d'années, de la présence chez les klebsielles des gènes bla, responsables de la résistance aux antibiotiques de la classe des pénicillines. Ces gènes sont associés de manière stable aux chromosomes qui les portent, et évoluent parallèlement aux spéciations, ce qui en fait de bons marqueurs d'espèces. D'autres marqueurs moléculaires permettant l'identification des espèces et leurs groupes phylogénétiques ont été développés.

La structure génétique de l'espèce K. pneumoniae est abordée par séquençotypage multilocus (MLST ; http://pubmlst.org/kpneumoniae ), ce qui permet d'identifier les clones majeurs de l'espèce et de typer les souches de manière standardisée. Nous avons utilisé cette méthode pour distinguer l'agent de l'ozène (infection chronique des voies respiratoires supérieures) des autres souches de K. pneumoniae.

Génétique des populations (Sylvain Brisse)

Nous avons participé à la découverte et la caractérisation génétique de Mycobacterium prototuberculosis, l'ancêtre de l'agent de la tuberculose. Le séquençage de plusieurs gènes a montré que les souches lisses qui causent la tuberculose en Afrique de l'Est et les membres du complexe Tuberculosis, qui causent la tuberculose sur tous les continents, forment une seule et même espèce, qui pourrait être vieille de 3 millions d'années. Les souches de cette espèce semblent échanger leurs gènes par recombination, phénomène jusqu'alors inconnu chez ces bacilles. Le complexe Tuberculosis représente un clone qui a connu un succès évolutif considérable après son émergence à partir de lignées de M. prototuberculosis il y a quelques dizaines de milliers d'années.

Centre Collaborateur OMS pour les Salmonella (Patrick Grimont, François-Xavier Weill et Martine Guibourdenche)

Le CCOMS tient à jour le schéma de White-Kauffmann-Le Minor qui décrit la formule antigénique de tous les sérotypes connus de Salmonella. De nouveaux sérotypes sont caractérisés chaque année. Il faut 190 sérums pour sérotyper toutes les souches de Salmonella. Environ 60 sont commercialisés. Les 130 autres sont fabriqués au CCOMS.

Le CCOMS entretient la collection de tous les sérotypes connus et de leurs variants. Le CCOMS a entrepris la caractérisation génétique des sérotypes (en particulier, séquençage des gènes de flagelline).

Nous avons contribué à établir la nomenclature internationale des espèces du genre Salmonella. Le CCOMS participe activement aux formations à travers du réseau Global Salm-Surv.

Centre National de Référence des Salmonella (François-Xavier Weill, Patrick Grimont)

Le CNR-Salm participe à la surveillance des salmonelloses en France en sérotypant complètement (avec 190 sérums) de 7000 à 10000 souches de Salmonella par an. Ces souches sont envoyées au CNR-Salm (accompagnées des renseignements épidémiologiques essentiels) sur une base volontaire par près de 1500 laboratoires d'analyses de biologie médicale (publics et privés). Le CNR collecte également les informations sur les souches dont le sérotype a été déterminé localement (15000 par an). Un système informatisé de surveillance et d'alerte des salmonelloses humaines permet de documenter les tendances spatiales et temporelles des principaux sérotypes de Salmonella et de détecter précocement toute augmentation anormale d'un sérotype aux niveaux national, régional ou départemental. Différents relevés épidémiologiques sont adressés chaque semaine à l'Institut de Veille Sanitaire (InVS). Dès la constatation d'une augmentation anormale d'un sérotype, un message d'alerte est envoyé. Le Centre effectue aussi la lysotypie de Salmonella sérotypes Typhi, Typhimurium, Paratyphi B, et Enteritidis et la caractérisation par électrophorèse en champ pulsé, ribotypie, profil d'hybridation à l'aide d'une sonde IS200 de divers sérotypes. Le CNR-Salm participe également au développement de nouvelles méthodes de typage (MLST) et de sous-typage (MLVA, prophage typing). Le CNR participe au Réseau européen Enter-Net.

Le CNR-Salm suit l'évolution de la résistance aux antibiotiques chez les Salmonella. Plus de mille souches tirées au sort parmi 15 sérotypes majeurs sont étudiées chaque année. Les mécanismes moléculaires impliqués dans l'émergence des résistances aux antibiotiques sont étudiés. Ainsi, en 2005, l'émergence de souches produisant les béta-lactamases à spectre élargi CTX-M-15 et CTX-M-27 et la céphalosporinase CMY-2 ainsi que l'émergence de souches du sérotype Paratyphi B multirésistantes aux antibiotiques par acquisition chromosomique du " Salmonella Genomic Island 1 " ont été publiées.

Centre National de Référence des Escherichia coli-Shigella (Francine Grimont et Patrick Grimont)

Le CNR-coli participe à la surveillance des shigelloses et des infections (colites hémorragiques et syndromes hémolytiques et urémiques ou SHU) à Escherichia coli producteurs de shigatoxine. Près de 1000 souches de Shigella sont identifiées et sérotypées par an. La détection de plusieurs gènes de virulence de E. coli est effectuée ainsi que le sérotypage classique et la ribotypie de certaines souches. Le CNR effectue la détection d'anticorps anti-LPS en cas de suspicion de syndrome hémolytique et urémique. Une méthode de sérotypage moléculaire étudiant les gènes impliqués dans la spécificité somatique O (région rfb) et flagellaire H (gène fliC) mise au point dans l'Unité est utilisée. Le CNR collabore au réseau national de surveillance du syndrome hémolytique et urémique (SHU) chez les enfants de moins de 15 ans en France (avec l'Hôpital Robert Debré, l'Institut de Veille Sanitaire et le Réseau des Pédiatres Néphrologues).

En 2005, 68 cas de SHU chez les enfants ont été confirmés par sérologie.

En octobre, une épidémie d'infections à E. coli O157 :H7 est survenue dans le Sud-Ouest de la France. Soixante six cas ont été identifiés, dont 18 ont présenté un SHU. Tous les patients avaient consommé de la viande hâchée surgelée du même lot. Des isolats de E . coli O157 :H7 portant les gènes codant les shigatoxines 1 et 2, l'entérohémolysine et l'intimine ont été retrouvés dans les selles de patients et dans la viande. Il s'agissait de la première épidémie à E. coli O157:H7 liée à des steaks hâchés observée en France. Le retrait des lots a permis de stopper l'épidémie.

Une autre épidémie d'infections à E. coli est survenue en Normandie en octobre. Elle serait due au sérotype O26 et associée à la consommation de fromage au lait cru.

Un groupe de 185 souches de Shigella non agglutinables, mannitol positif et indole négatif, reçues de divers pays (Afrique, Asie, Amérique du Sud) a été caractérisé. Ces souches avaient le même biotype, ribotype, et profils de restriction du gène de flagelline cryptique et de la région rfb (impliquée dans la spécificité O) ainsi que les mêmes gènes codant l'invasivité et l'entérotoxine 2 (ShET-2). Ce groupe appartient au nouveau sérotype S . boydii 20.

Centre National de Référence pour Corynebacterium diphtheriae (Patrick Grimont et Anne Le Flèche)

Le CNR-Cd confirme l'identification des Corynebacterium diphtheriae, C. ulcerans, et C. pseudotuberculosis, recherche le gène de la toxine diphtérique par amplification génique, et effectue le typage moléculaire des souches par ribotypie.

Nous avons contribué à montrer que le chien infecté pouvait transmettre C. ulcerans toxinogène à l'homme immunodéprimé ou fragilisé.

En 2005, un cas d'infection à C. pseudotuberculosis toxinogène a été déclaré à l'InVS. La souche provenait d'une plaie infectée. Les infections à C. pseudotuberculosis sont connues chez le cheval, le mouton, la chèvre et les bovins. De rares contaminations de l'homme ont déjà été décrites en Australie.

Dans le cadre du réseau OMS-Europe ELWGD (European Laboratory Working Group on Diphtheria) et du réseau DIPNET (DG-SANCO), une base de donnée de ribotypes de C. diphtheriae a été construite après étude de 576 souches isolées dans de nombreux pays dont l'ancienne URSS. Ces souches se distribuent en 86 ribotypes. Le logiciel Taxotron a été choisi pour l'identification automatique des ribotypes. Une nomenclature internationale des ribotypes a été publiée.

Centre d'Identification Moléculaire des Bactéries (Anne Le Flèche et Patrick Grimont)

Le CIMB a été créé en 2000 pour identifier toutes sortes de bactéries par des méthodes moléculaires en première intention (séquençage du gène rrs ou rpoB, ribotypie automatisée, amplification génique). Les souches étudiées proviennent de laboratoires cliniques, vétérinaires, industriels ou de l'environnement. En 2005, parmi 690 souches étudiées par séquençage, 83% ont été identifiées à 226 espèces valides, 8% étaient proches d'espèces taxonomiquement mal délimitées, 8% formaient 55 espèces nouvelles et 1% représentait 4 genres nouveaux. Les souches non industrielles qui ne correspondent à aucune espèce décrite, sont inclues dans nos programmes de recherche taxonomique. Certaines observations cliniques originales (infections à Flexispira rappini et à de nouvelles espèces de Janibacter et Neisseria bacilliforme) ont été publiées avec nos correspondants.

En hiver 2004-2005, le CIMB fut contacté par l'Institut de veille sanitaire concernant la survenue d'infections invasives à Enterobacter sakazakii (Es) chez des nouveau-nés. L'investigation a eu pour objectifs d'évaluer l'ampleur de l'épidémie, de confirmer sa source et de mettre en place des mesures de contrôles. Le CIMB a effectué l'identification (par séquençage du gène rpoB) et le typage rapide (par ribotypie automatisée) des souches Es. Il s'agissait des premiers cas groupés en France d'infection à Es associés à une préparation en poudre pour nourissons, et ayant entraîné le rappel du produit contaminé. Le CIMB a joué un rôle de Centre de Référence.

Légendes des photos :

Comparaison de flores bactériennes de souris (A1 à A8 et B1,B2) par la technique TTGE. Chaque bande correspond à une espèce bactérienne.

Mots-clés: Bactériologie, Taxonomie, Phylogénomique, Entérobactéries, Typage moléculaire, Identification, Génétique des populations



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Sylvain, Chantal (csylvain@pasteur.fr )

Valérie Abihssira (abihssir@pasteur.fr )

Brisse, Sylvain, Institut Pasteur (CR, sbrisse@pasteur.fr )

Grimont, Francine, INSERM (CR1, fgrimont@pasteur.fr )

Grimont, Patrick, Institut Pasteur (Professeur, pgrimont@pasteur.fr )

Weill, François-Xavier, Institut Pasteur (Médecin-Biologiste, fxweill@pasteur.fr )

Ait Tayeb, Lineda, thésarde

Delétoile, Alexis, thésard

Diancourt, Laure, contrat

Elhani, Dalèle, stagiaire

Fèvre, Cindy, thésarde

Tachon, Sybille, DEA

Guibourdenche, Martine (Ingénieur CCOMS, mguibour@pasteur.fr )

Le Flèche, Anne (Ingénieur Technologue CIMB, lefleche@pasteur.fr )

Brézillon, Christophe (Ingénieur, cbrezill@pasteur.fr )

Arnoux, Yolande (Tech., CIMB)

Berland, Laetitia (Tech., CNR Salmonella)

Carle, Isabelle (Tech., CNR E. coli-Shigella)

Chavinier-Jove, Brigitte (Tech., CCOMS)

Demartin, Marie (Tech., CNR Salmonella)

Guesnier, Françoise (Tech., CNR Salmonella)

Guibert, Véronique (Tech, CNR Salmonella)

Issenhuth-Jeanjean, Sylvie (Tech., R&D CNR Salmonella)

Lefevre, Martine (Tech., CIMB)

Lejay-Collin, Monique (Tech., CNR E. coli-Shigella)

Le Roux, Karine (Tech., CNR E. coli-Shigella)

Lomprez, Fabienne (Tech., CIMB)

Passet, Virginie (Tech.)


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