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     Dynamique du génome


  Responsable : Arcangioli Benoit (barcan@pasteur.fr)


  resume

 

Nous avons identifié les éléments de séquences responsables d'une empreinte chromosomique, au locus sexuel de la levure S. pombe. La nature moléculaire de l'empreinte a été déterminée et un système de cassure simple brin inductible a été construit et validé. Par ailleurs, nous avons démontré que le gène pli1 code pour une SUMO E3 ligase, qui joue un rôle important dans l'homéostasie des télomères et la stabilité des centromères.



  rapport

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Nos travaux antérieurs ont permis de mettre en évidence l'existence d'une lésion d'ADN simple brin au locus sexuel mat1, chez la levure S. pombe. Le mécanisme de formation et la nature moléculaire de la lésion chromosomique est encore vague, cependant elle requiert une réplication polarisée du locus sexuel mat1.

Nature moléculaire de l'empreinte à mat1 Atanas Kaykov

Afin de mieux comprendre la régulation de la formation et de la stabilité de l'empreinte, Atanas Kaykov a entrepris une mutagénèse dirigée systématique de cette region (100 pb). Nous avons identifié le site d'action in vivo de la protéine Swi1 par chromatine immunoprécipitation (ChIP) à une séquence de 6 nucléotides essentielle à la pause de la réplication (MPS1) et à la formation de la CSB. Par ailleurs, deux autres sites ont été identifiés comme essentiels dans la stabilité de l'empreinte (Kaykov et al, 2004).

La nature moléculaire de la lésion est sujette à polémique. Une autre équipe a publié que la lésion était un ARN, provenant d'une amorce ARN d'un fragment d'Okazaki (Dalgaard & Klar, 1999) et plus récemment à une oxydation en position 2' du sucre (Vengrova & Dalgaard, 2004). Cette notion a été activement contrée par notre équipe et nous avons montré que l'empreinte est une cassure simple brin (3'OH, 5'OH), sans nucléotide manquant, résistant aux RNases, spécifique de site et indépendante de la séquence (Kaykov et Arcangioli, 2004).

Un système inductible de cassure simple brin. Allyson Holmes, Xiaowei Sun

Récemment Allyson Holmes a construit et validé un système inductible de formation de la CSB et changement de type sexuel. Sur des cellules sans cassures "vierges" (de type sexuel uniques) et synchronisées dans le cycle cellulaire, nous pouvons observer la cinétique de différents évènements. Dans un premier temps, la fourche de réplication pause à MPS1 et Swi1 s'accumule à mat1 (par chromatine immunoprécipitation). La CSB apparaît sur les premiers intermédiaires de réplication (structure-Y en gels natifs en deux dimensions), sur le brin néosynthétisé discontinu. Swi1 continue à accumuler jusqu'à la fin de la phase-S puis disparaît en début de G2 alors que la CSB reste stable. Lors de la seconde phase-S, une cassure double brin polaire transitoire est formée et les premiers intermédiaires de conversion génique sont observés. L'analyse par micromanipulation du pedigree des cellules en division, montre que deux générations sont nécessaire pour qu'une cellule sur quatre change de type sexuel (Holmes, Kaykov et Arcangioli, 2005). Ce système est utilisé pour rechercher les gènes impliqués dans la formation ou maintenance de la CSB.

Couplage de la recombinaison avec la réplication. Laura Roseaulin

Le rôle de la recombinaison au cours de la réplication de l'ADN est mal connu. Nous étudions les processus impliqués lors de la collision de la fourche de réplication avec une CSB de l'ADN, qui est alors converti en cassure double brin (CDB). La réparation, tout en conservant la séquence parentale doit reconstruire une structure de la fourche de réplication permettant le redémarrage de la réplication. En utilisant l'empreinte du locus sexuel nous avons déterminé qu'elles étaient les gènes impliqués dans la survie cellulaire. Cette étude a permis de mettre en évidence deux types de réparation par recombinaison homologue utilisant soit la chromatide sœur soit une séquence homologue ailleurs dans le génome. Les intermédiaires moléculaires générés dans ce processus sont analysés.

Role de Tdp1 dans la survie des cellules à l'état quiescent (G0) Samia Ben Hassine

L'ataxie spinocerebelleuse neurodégérative (SCAN1) est due à une mutation du gène de la tyrosyl phosphodiesterase 1 (Tdp1). Nous avons montré chez S. pombe que Tdp1 est important pour réparer certaines lésions simple brin. De plus les cellules mutées dans Tdp1 montrent une survie très limitée à l'état quiescent (G0), pouvant rendre compte du syndrome neurologique. Nous tentons de comprendre les raisons de cette sensibilité.

Pli1 code pour une E3-SUMO ligase essentielle pour la stabilité des chromosomes. Blerta Xhemalce

La sumoylation semble participer activement dans l'adressage de certaines protéines dans des structures cellulaires. Blerta Xhemalce en collaboration avec Jacob Seeler (Unité de l'organisation Nucléaire et Oncogénèse) ont montré que Pli1 est une E3 SUMO-ligase. Les levures mutantes dépourvues du gène pli1 sont viables, cependant certaines régions chromosomiques (locus sexuel, centromères et télomères) deviennent instables (Xhemalce et al. 2004). Nous avons montré que l'augmentation des répétitions télomèrique induite par l'absence de Pli1 (sumoylation) est due à une augmentation de l'activité de la télomérase.

Légendes des photos :

Deux divisions asymétriques successive sont nécessaires pour qu'une cellule sur quatre cousines change de type sexuel. La stabilité de la cassure simple brin se comporte comme une empreinte chromosomique, prédestinant le devenir des cellules filles. Le profil de division est analogue à celui précédemment proposé pour les cellules souches.

Mots-clés: Empreinte chromosomique, réplication, recombinaison, réparation, cancer



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