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     Défense innée et Inflammation - Inserm E336


  Responsable : CHIGNARD MICHEL (chignard@pasteur.fr)


  resume

 

Nos travaux concernent la défense innée et l'inflammation au niveau pulmonaire et utilisent diverses approches in vitro ainsi que des modèles animaux. Dans un contexte de pathologies infectieuses, nous étudions le rôle des cellules épithéliales respiratoires, des macrophages alvéolaires, des polynucléaires neutrophiles et des monocytes. Une attention plus spécifique est centrée sur certaines molécules comme les "Toll-like receptors" (TLR), le récepteur de l'urokinase (CD87), ou encore les phospholipases A2 (PLA2) (voir figure).



  rapport

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Les poumons sont le siège de différentes pathologies dans lesquelles les mécanismes de défense innée et d'inflammation interviennent de façon essentielle. Parmi celles-ci figurent des pathologies majeures telles que le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), la broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO), la mucoviscidose, ou encore les pneumopathies infectieuses d'origine bactérienne, fongique ou virale. Le processus de défense innée est naturellement bénéfique, mais son exacerbation peut conduire à des états inflammatoires préjudiciables. C'est dans ce contexte que nos travaux se proposent d'apporter une meilleure connaissance qualitative et quantitative des mécanismes impliqués, et pourraient permettre de cibler les évènements favorisant la défense innée sans augmenter la composante inflammatoire.

Interactions cellulaires dans l'environnement aérien pulmonaire (Michel Chignard, Dominique Pidard et Mustapha Si-Tahar)

Parmi les stimuli microbiens capables de déclencher une réponse immunitaire innée, nous nous sommes intéressés au LPS, un composé pariétal des bactéries Gram- et à l'ARN double-brins (ARNdb), un intermédiaire réplicatif produit par les virus. Le LPS est un activateur du TLR4 (et/ou du TLR2 dans certains cas) alors que l‘ARNdb est un puissant agoniste du TLR3. Le rôle in vivo de ces TLRs dans la détection et/ou le développement infectieux de pathogènes tels que la bactérie opportuniste Gram- Pseudomonas aeruginosa et le virus grippal influenza a été peu étudié. Dans ce but, deux types de travaux ont été réalisés. Premièrement, la sensibilité de souris doublement déficientes en TLR4 et TLR2 a été examinée dans un modèle expérimental d'infection aiguë à P. aeruginosa. Nous avons observé que ces souris ne présentent pas de sensibilité accrue à cette bactérie, étant capables de produire une réponse immunitaire efficace qui élimine rapidement la bactérie, en dépit d'une production anormalement réduite de cytokines inflammatoires tels que le TNF-alpha et KC. En revanche, des souris déficientes en MyD88, une molécule adaptatrice associée à la signalisation de tous les TLRs (à l'exception du TLR3) sont particulièrement sensibles à l'infection par P. aeruginosa, 100% des souris infectées mourant en 48 h. Ainsi, ces données démontrent que le LPS exprimé par P. aeruginosa n'est pas essentiel à l'infection aiguë déclenchée par cette bactérie. Implicitement, nos données suggèrent qu'un autre facteur de virulence capable d'activer une réponse MyD88-dépendante soit en revanche plus critique dans cette pathologie respiratoire (collaboration avec l'unité de Recherche et d'Expertise Histotechnologie et Pathologie).

Par ailleurs, nous nous sommes intéressés à la grippe, une infection courante qui peut parfois être mortelle. Le virus influenza, l'agent responsable, est un virus respiratoire hautement contagieux qui échappe aux défenses immunitaires spécifiques de l'hôte grâce à son extrême variabilité génétique. Nous avons précédemment démontré à l'aide d'approches in vitro que TLR3 est important dans la réponse inflammatoire post-infection grippale. Nous avons validé ces résultats dans un contexte in vivo grâce à l'utilisation d'un modèle murin. Nos travaux démontrent notamment une résistance accrue des souris TLR3-/- au virus de la grippe. Paradoxalement, nous montrons que ces souris produisent moins de médiateurs inflammatoires dont le RANTES, l'IL-6 et l'IL-12p40/p70 et ne développent pas d'anticorps spécifiques contre le virus. De plus, le recrutement de lymphocytes T CD8+ est moindre au niveau des voies aériennes, en comparaison avec celui observé chez des souris témoins. Ces résultats suggèrent donc qu'une réponse immunitaire innée et acquise excessive, relayée par TLR3, est délétère pour l'hôte dans le contexte d'une pneumonie grippale aiguë.

Un modèle expérimental d'étude de la réponse innée pulmonaire au cours d'infections par Aspergillus fumigatus, un champignon responsable de l'aspergillose pulmonaire invasive (API) chez les patients immunodéprimés, a par ailleurs été réalisés chez la souris. Notre approche a été centrée sur l'analyse, au cours de la progression de l'API, de différents paramètres caractéristiques de la réponse innée, et en fonction de l'expression de différents TLR. Nous avons montré que TLR2 jouait un rôle important dans la réponse immune vis-à-vis d'A. fumigatus. Ainsi, nous avons mis en évidence qu'au cours de l'infection in vivo, la détresse respiratoire ainsi que la charge en pathogènes sont plus importantes chez les souris déficientes, et que leur survie est diminuée (collaboration avec l'unité des Aspergillus et celle de Recherche et d'Expertise Histotechnologie et Pathologie). Nous avons également montré que les macrophages alvéolaires des souris déficientes pour ce récepteur, produisaient moins de cytokines et de chimiokines que ceux des animaux sauvages en réponse au champignon. A côté des macrophages, nous avons commencé à étudier plus spécifiquement la réponse des cellules épithéliales respiratoires (lignées de cellules d'origine humaine) à une infection par A. fumigatus.

Les archétypes moléculaires de la défense innée contre les pathogènes sont les peptides antimicrobiens (PAM). Nous avons commencé un projet de recherche s'intéressant à la production de PAM par les cellules épithéliales respiratoires activées par différents agonistes des TLR. Différents peptides cationiques, potentiellement porteur d'une activité antimicrobienne, ont été identifiés par une approche de protéomique (collaboration avec la plateforme d'Analyse et de microséquençage des protéines).

Au cours d'un processus infectieux et inflammatoire pulmonaire, les protéinases libérées tant par les cellules de l'hôte (macrophages alvéolaires, polynucléaires neutrophiles, cellules épithéliales) que par des pathogènes bactériens (tel que P. aeruginosa chez les patients mucoviscidosiques) jouent un rôle important comme effecteurs de l'immunité, mais aussi comme facteurs délétères dans diverses pathologies, telles que le SDRA ou la mucoviscidose. Un récepteur membranaire exprimé de façon ubiquiste dans le poumon, le récepteur de l'urokinase (uPAR/CD87), joue un rôle important dans la recrutement des cellules inflammatoires et dans la réparation tissulaire. Son activité est connue pour être régulée par des protéinases, positivement (expression d'un motif chimiotactique) ou négativement (perte de domaines fonctionnels d'adhérence cellulaire). Nous avons (i) analysé la capacité de protéinases leucocytaires, épithéliales et bactériennes de cliver CD87, (ii) établi pour chacune les sites de clivage (collaboration avec la Plate-forme de Protéomique), et (iii) commencé à analyser l'impact du clivage sur les fonctions du récepteur (adhérence cellulaire et chimiotactisme). Nous avons également montré que chez des patients atteints d'un SDRA, il existe, dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA), une forme soluble de CD87, dont la concentration va de paire avec la présence de protéinases leucocytaires.

Mécanismes de régulation et rôles des phospholipases A2 dans les pathologies inflammatoires pulmonaires (Lhousseine Touqui)

Les PLA2 constituent une vaste famille d'enzymes qui hydrolysent les phospholipides membranaires en position sn-2, conduisant à la libération de lysophospholipides et d'acides gras libres. Parmi ces acides gras, l'acide arachidonique (AA) est le précurseur des prostaglandines produites par la cyclooxygènase (COX), une enzyme qui existe sous une forme constitutive ou COX-1 et une forme inductible ou COX-2. Les prostaglandines jouent un rôle important dans la modulation du processus inflammatoire pulmonaire. Des données de la littérature ont montré que les concentrations des métabolites de l'AA dans les LBA de patients souffrant de mucoviscidose ou de SDRA sont plus élevées que celles observées chez des sujets sains.

Parmi les PLA2, on distingue la PLA2 cytosolique (cPLA2) et les PLA2 sécrétées (sPLA2). Chez les mammifères, celles-ci sont subdivisées en plusieurs types comprenant entre autres la sPLA2-IIA. Cette sPLA2-IIA joue un rôle majeur dans le développement des maladies inflammatoires en particulier dans la défense innée vis-à-vis des bactéries pathogènes. Nous avons montré que la sPLA2-IIA exerce un effet bactéricide sur les spores germées de Bacillus anthracis, l'agent étiologique de l'anthrax. Par ailleurs, une activité anthracide liée à la sPLA2-IIA a été mise en évidence dans les LBA humains et le surnageant de macrophages alvéolaires qui représentent la source principale de la sPLA2-IIA dans les tissus pulmonaires. De manière intéressante, nous avons observé que l'expression de la sPLA2-IIA par les macrophages alvéolaires était inhibée par la toxine létale de B. anthracis à un niveau transcriptionnel par un mécanisme non encore identifié. Enfin, nous avons démontré que les souris transgéniques pour la sPLA2-IIA ou les souris sauvages ayant reçu une instillation de cette enzyme survivent à une infection par B. anthracis, alors que les souris sauvages non traitées à la sPLA2-IIA, meurent en moins de 3 jours après l'infection. Ces résultats montrent que la sPLA2-IIA joue un rôle dans la défense innée vis-à-vis de B. anthracis et que la toxine létale pourrait aider la bactérie à échapper à l'action bactéricide de la sPLA2-IIA en inhibant la synthèse de cette enzyme.

Par ailleurs, nous avons étudié le rôle potentiel de l'AA et ses métabolites dans l'inflammation pulmonaire dans le contexte de la mucoviscidose. Une libération accrue de l'AA a été observée in vitro avec des cellules épithéliales humaines portant la mutation Δ F508 de la protéine CFTR (CFT-2) en comparaison avec des cellules épithéliales témoins (NT-1). Cette libération est accompagnée d'une surproduction de la prostaglandine E2 (PGE2) et d'une induction de la synthèse et de l'activité de la sPLA2-IIA dans les cellules CFT-2 par rapport aux cellules NT-1, au cours de la stimulation par le LPS de P. aeruginosa. Nos études ont également montré que ce LPS induit chez les souris CFTR -/- une augmentation des concentrations de la PGE2 dans les LBA, en comparaison avec les souris CFTR +/+. Enfin, nous avons mis en évidence l'existence d'un lien entre la mutation Δ F508 de CFTR et la production de PGE2 par les cellules épithéliales. Cette surproduction n'est pas due à la mutation elle-même mais à l'absence de CFTR à la surface de la membrane plasmique. En effet, un ré-adressage de CFTR par une approche pharmacologique diminue la production de la PGE2 par les cellules CFT-2 qui deviennent alors comparables à celle observée avec les cellules témoins NT-1. Ces résultats mettent en évidence un lien direct entre la mutation de CFTR et la production des prostaglandines et suggèrent que ce processus pourrait jouer un rôle dans l'exacerbation de la réaction inflammatoire pulmonaire chez les patients atteints de mucoviscidose. Des études sont en cours pour analyser le rôle de différentes PLA2 et des prostaglandines dans l'hyper-sécrétion du mucus par les poumons des souris CFTR -/-. En effet, l'excès du mucus, associé à l'absence de la clairance mucociliaire, jouent un rôle majeur dans la pathogénie de la mucoviscidose.

Mots-clés: immunité innée/inflammation, infection, cellules épithéliales, leucocytes, Toll-like receptors, protéinases, phospholipases A2, CD87, pneumopathie, mucoviscidose



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  VILLENEUVE Josiane (jvillene@pasteur.fr) CHIGNARD Michel, INSERM, (DR1, chignard@pasteur.fr)

PIDARD Dominique, CNRS, (CR1, dpidard@pasteur.fr)

SI-TAHAR Mustapha, INSERM, (CR1, sitahar@pasteur.fr)

TOUQUI Lhousseine IP, (Chef de Laboratoire, touqui@pasteur.fr)

BOUTILLON Florence, Licence professionnelle

BEAUFORT Nathalie, Thèse

CHIOU Shean-Jaw, Professeur invité

DIF Fariel, Post-doctorat

LABEGUERIE Marylène, Master 2

LE GOFFIC Ronan, Post-doctorat

MEDJANE Samir, Thèse

MOUBARECK Carole, Post-doctorat

RAYMOND Benoît, Thèse

BALLOY Viviane, (Assistante-ingénieur, INSERM, vballoy@pasteur.fr)

LEDUC Dominique, (Technicienne, IP, dleduc@pasteur.fr)


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