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     Carcinogenèse hépatique et virologie moléculaire


  Responsable : PATERLINI -BRECHOT Patrizia (paterlini@necker.fr)


  resume

 

Les infections par le VHB et le VHC (environ 350 millions de personnes dans le monde sont infectées par le VHB et 300 millions par le VHC) sont caractérisées par le risque fort de passage à la chronicité (5% chez l'adulte pour le VHB, 60-80% en néonatal ; 70-80% pour le VHC) ce qui implique le risque de développer une cirrhose et un cancer du foie (HCC). Les traitements antiviraux ont indiscutablement progressé avec l'utilisation de l'interféron et de la Lamivudine pour le VHB et l'association de l'interféron à la ribavirine pour le VHC. L'efficacité de ces traitements reste cependant insuffisante, permettant un taux de réponse prolongée de 30 à 40% en moyenne pour le VHC.

La carcinogenèse hépatique est liée à la combinaison dans le foie d'un patient porteur chronique du VHB ou du VHC, de l'inflammation chronique, des effets directs de protéines virales et (pour le VHB) de l'intégration du génome viral : 1) l'inflammation joue un rôle essentiel dans formation de la fibrose et la dérégulation de la prolifération hépatocytaire. Ce point est illustré par le développement des HCC dans environ 90% des cas sur un foie cirrhotique ou avec hépatite chronique active, le risque d'HCC chez un patient cirrhotique étant d'environ 30-50 % après dix ans de suivi. 2) certaines protéines du VHB et du VHC, ainsi que l'insertion de l'ADN du VHB dans l'ADN chromosomique, exercent des effets directs sur la prolifération et la viabilité hépatocytaire, sur la réponse à l'interféron et sur la production des cytokines (TNFalpha). 3) des altérations génétiques récurrentes (délétions et amplifications de certains loci chromosomiques), ont été récemment identifiées grâce au développement des analyses génétiques appliquées aux HCC. (Revues générales:Ozturk Seminars in liver diseases, 1999,19:235. Bréchot : Seminars in Cancer Biology, 2000;10:211-231; Buendia: Viral Hepatitis; Zuckerman et Thomas Ed, Churchill Livingstone 1998, 179-200 ; Thorgeirsson SS, Grisham JW, Nature Genetics, 31, 339,2002).



  rapport

cale

Dans ce contexte, le programme de notre groupe est centré sur les points suivants :

Prolifération et adhésion hépatocytaire :

1) Equipe C. Desdouets - Ce groupe a initié une étude sur les mécanismes qui régulent la ploîdie hépatocytaire, à la fois au cours du développement hépatique et dans des conditions pathologiques comme au cours des infections virales et aux différents stades de la carcinogenèse hépatique. Les approches techniques permettant la quantification du contenu en ADN des noyaux hépatocytaires, l'étude des protéines ayant un rôle dans la cytodiérèse, et l'implication des inhibiteurs des kinases (P27 et P21) sont en train d'être mises au point ou sont en cours d'application. Au cours de l'année 2003 cette équipe a caractérisé la cinétique in vivo de la polyploïdisation hépatique et démontré que le blocage de la cytokinèse détermine la formation d'hépatocytes binuclées, une étape fondamentale dans le processus de polyploidisation.

2) Equipe L. Christa  - Protéine HIP, adhésion hépatocytaire et marquage de cellules "progénitrices" :Cette équipe a montré l' interaction de cette lectine de type C avec la sous-unité RIIa de la PKA. Le projet en cours vise la définition de la fonction de la protéine HIPPAP in vivo, dans des cellules souches embryonnaires et hépatiques, au cours de la régénération hépatique chez la souris transgénique, et in vitro, par la recherche d'intéractions protéine-protéine (méthode protein chip Ciphergen)

Persistance des virus B (VHB) et C (VHC) :

Equipe D. Kremsdorf - a) Les travaux de l'équipe ont démontré qu'in vivo l'expression de la protéine HBSP, codée par l'un des ARNs épissés du VHB. Cet ARN épissé est également encapsidé et rétrotranscrit et donne lieu à la sécrétion de particules défectives. L'expression de la protéine HBSP et un rapport particules défectives/sauvages significativement plus élevé ont été observés chez des patients avec fibrose sévère comparé à des patients avec fibrose modérée ou nulle. In vitro, l'expression de la protéine HBSP induit une activation modérée de la voie de signalisation du TGFα . Ces résultats suggèrent que la protéine HBSP et les particules défectives jouent un rôle dans la pathogenèse de l'infection par le VHB et en particulier dans la fibrose hépatique. b) Nous nous sommes également intéressés à la caractérisation des propriétés biologiques de la protéine HBx du VHB; ceci afin de mieux définir l'implication de cette protéine dans la carcinogenèse hépatique. Une approche transcriptome a montré que parmi les gènes cellulaires donc l'expression est augmentée après la transduction d'hépatocytes humains avec un lentivirus HBx, le gène du récepteur de l'acide gamma-aminobutyric (GABA) de type A α 3 est significativement surexprimé d'environ 3 fois par rapport au contrôle. L'impact de la surexpression du récepteur GABAA α 3 sur l'inhibition de la prolifération cellulaire induite la protéine HBx sera évaluée. c) L'équipe a établi le modèle murin de repopulation d'hépatocytes humains dans le foie de souris immunodéficientes et transgéniques pour l'activateur du plasminogéne de type urokinase. La persistance de la greffe d'hépatocytes humains a été améliorée de façon significative en diminuant la réponse immunitaire innée. Le niveau de la différenciation hépatocytes transplantés a été confirmé par la susceptibilité des hépatocytes humains à l'infection par le VHB. Ceci constitue une avancée majeure pour l'étude de nouvelles molécules antivirales. De plus, ce modèle murin a permis de démontrer que des lignées hépatiques adultes de souris ont la capacité de proliférer dans en contexte de régénération hépatique.

Carcinogenèse hépatique et infections virales (VHB, VHC):

1) Equipe N. Pavio, C. Bréchot - Cette équipe étudie l'effet biologique de séquences de capside du VHC isolées à partir du tissu tumoral et non tumoral de patients avec cancer du foie. Récemment, elle a mis en évidence que les variants de capside isolés à partir de tissus tumoraux inhibent de manière ciblée la voie du TGF-_ impliquée dans la fribrose et le contrôle de la prolifération cellulaire. L'étude du mécanisme moléculaire a mis en évidence une interaction directe entre les capsides tumeur avec Smad3, un des facteurs de transcription activé par le TGF-_ et un blocage de l'interaction du complexe Smad3/4 avec l'ADN. Ce processus pourrait contribuer au développement du CHC.

2) Equipe V. Thiers - F. Demaugre - Nous développons un projet ayant pour objectif d'étudier à partir de cellules hépatocytaires isolées par microdissection laser chez des sujets ayant développé un CHC sur cirrhose virale C : 1) la variabilité intra-hépatique de la capside du VHC afin d'identifier de nouveaux variants naturels de la protéine de Capside du VHC 2) l'étude comparative des protéomes d'hépatocytes tumoraux et non-tumoraux. L'approche repose sur l'association de l'électrophorèse bi-dimensionnelle (2D-PAGE) et de la spectrométrie de masse pour identifier les protéines différentiellement exprimées dans le CHC lié au VHC. L'objectif à terme de cette étude est d'utiliser les données obtenues dans cette investigation, pour définir de nouveaux outils diagnostiques et/ou thérapeutiques pour le traitement du cancer du foie. Parallèlement, le Centre de Référence pour les hépatites B et C contribue à la surveillance moléculaire et à l'identification des risques résiduels de transmission de ces virus.

3) Equipe Patrizia Paterlini-Brechot- Récemment nous avons démontré l'impact de la signalisation calcique dans le mécanisme d'action de la protéine core du VHC. En effet, nous avons montré que la protéine capside du VHC détermine la réduction de la concentration calcique du RE, un mécanisme qui conduit à la mort cellulaire par apoptose in vitro et in vivo par un mécanisme calcium dépendant (Benali-Furet et al, 2005). Ces effets sont très intéressants dans le cadre des études sur la carcinogenèse hépatique. Un nouvel axe de recherche basé sur l'hypothèse que la modulation de la concentration calcique induite par la capside du VHC (Benali-Furet, 2005) peut avoir un rôle important en santé public et en carcinogenèse hépatique. Des données récentes de notre équipe montrent que l'action de trois drogues capables de réduire la concentration calcique du Réticulum Endoplasmique (RE), détermine, dans un modèle "Replicon" du VHC, la baisse de l'accumulation des protéines (NS3, E2 et la capside) du VHC, démontrée par western blot, et de la quantité de l'ARN viral, démontrée par PCR quantitative en temps réel. L'analyse de la modulation de la concentration calcique par l'utilisation de la sonde aequorine ciblée au RE a révélé une baisse significative de la concentration calcique induite par ces trois drogues. Puisque le RE est le siège de la réplication et de la maturation des protéines du VHC, la baisse du niveau de calcium dans le RE semble être en mesure de baisser la réplication et l'expression des protéines virales.

Nouvelles approches pour le traitement des HCC

Equipe J. Faivre : Thérapie génique : NIS est une glycoprotéine de transport membranaire qui catalyse le transport actif de l'iodure circulant dans le tissu thyroïdien. Cette capacité des cellules thyroïdiennes à concentrer activement l'iode via NIS permet la destruction des tumeurs thyroïdiennes par l'iode 131 administré après la thyroïdectomie, améliorant significativement le pronostic des patients. Nous avons montré l'intérêt de cette approche thérapeutique dans le cancer primitif du foie par transfert du gène NIS dans le foie tumoral pour qu'il acquière la propriété de capter l'iode radioactif, suivi de radiothérapie à l'iode 131 (Faivre et al. Cancer Res. 2004.1;64(21):8045-51). Nous avons montré dans un modèle animal de carcinome hépatocellulaire que, dans le foie infecté par un vecteur viral recombinant CMV-NIS, la captation de l'iode par les hépatocytes est non seulement forte (30 % de l'iode administré dans le foie exprimant NIS contre 2 % dans le foie n'exprimant pas NIS) mais aussi prolongée dans le temps (demi-vie biologique de l'iode de 2,5 jours). Ce résultat contraste fortement avec l'efflux massif et rapide observé in vitro et in vivo dans les tumeurs xénogreffées, d'où un temps de séjour de l'iode trop bref pour espérer un dépôt de dose de radiation suffisant. Une inhibition de la croissance tumorale des gros nodules, ainsi qu'une régression complète de petits nodules et une augmentation de la survie ont été observées après injection de 18mCi d'iode 131. Nos travaux se poursuivent par l'optimisation du ciblage de l'expression du NIS dans le seul foie tumoral. L'utilisation de séquences régulatrices ubiquitaires telles que le promoteur du CMV entraîne l'expression de NIS dans les cellules normales et tumorales, et donc un risque de toxicité majeur de l'irradiation. Notre objectif est de détruire les tumeurs hépatiques par radiothérapie interne en évitant que la dose d'irradiation globale soit toxique pour la moëlle osseuse. Nous avons défini de nouveaux vecteurs recombinants capables d'induire, après transfert, une accumulation de radioélément spécifiquement dans les cellules tumorales du foie via l'expression de NIS dans ces cellules. Ce ciblage de l'expression de NIS permet d'irradier fortement les seules tumeurs, tout en minimisant la dose d'irradiation corporelle globale (manuscript en préparation).

2) Equipe Patrizia Paterlini-Brechot- Cellules métastatiques: suite à nos résultats sur l'intérêt pronostic du test ISET chez les patients avec cancerdu foie (Vona et al, 2004) nous avons émis l'hypothèse que l'identification cytopathologique sensible et spécifique des cellules tumorales circulantes par la méthode ISET des patients avec cancer de la prostate puisse prédire la récurrence après prostatectomie. Au moment du diagnostic, le sang circulant de 109 patients avec un adénocarcinome de la prostate localisé et subissant une prostatectomie a été testé par la méthode ISET pour la présence deCTC. L'identification précoce sensible et spécifique des CTC par la méthode ISET a permis d'identifier des patients avec une tumeur localisée qui ont un haut risque de développer une récurrence après prostatectomie. Cette information est très importante pour adresser sélectivement des traitements adjuvants aux patients avec un cancer invasif.

Recherche clinique et thérapeutique :

Nous avons organisé la constitution de banques d'ADN de patients infectés par le VHC et des patients ayant une cirrhose alcoolique pour la recherche de polymorphismes génétiques associés aux différentes formes de maladie hépatique. Plusieurs études pharmacologiques et une étude de vaccinothérapie (VHB) sont en cours pour l'amélioration du traitement des hépatites virales B et C. Nous sommes en train d'analyser l'impacte de l'infection par le VHC sur le métabolisme lipidique et son rapport avec la virémie, les traitements anti-viraux et par fibrates. Nous avons analysé les profils évolutifs des maladies biliaires cholestasiantes du foie et réalisé l'évaluation des traitements actuellement proposés. Un projet centré sur l'intervention de facteurs génétiques impliqués dans le déclenchement et/ou la sévérité de la CBP est en cours de développement.

1) Equipe ML Michel -Prévention et traitement des infections virales chroniques par vaccination spécifique- Le travail de cette équipe est orienté vers la prévention et l'immunothérapie des infections chroniques dues aux virus de l'hépatite B (VHB) et de l'immunodéficience humaine (VIH). Un essai clinique de phase I de vaccinothérapie spécifique basé sur l'injection d'ADN nu codant pour les protéines d'enveloppe du VHB a été réalisé en collaboration avec le service d'hépatologie de l'hôpital Necker (Pr. Brechot, Pr. Pol and Dr. H. Fontaine). L'équipe a montré que des réponses T spécifiques du VHB peuvent être induites ou réactivées chez des patients porteurs chroniques du virus. Un essai de phase II est prévu étudier l'efficacité clinique de cette approche. L'identification de séquences épitopiques au sein des protéines HBx et HBSP du virus de l'hépatite B est réalisée au moyen de souris transgéniques pour les molécules du CMH-I humain (collaboration Y-C Lone, I.P.). Ces études servent de base à des protocoles de recherche clinique destinés à mettre en évidence la présence de lymphocytes T spécifiques dans différentes situations cliniques liées à l'infection par le VHB.Dans le modèle animal du singe infecté par le virus de l'immunodéficience simienne (SHIV), cette équipe a étudié, après épreuve infectieuse par le virus SHIV, le devenir des cellules T CD4+ et CD8+ activées par vaccination spécifique. Contrairement aux cellules T CD8+ qui sont rappelées par l'infection, les cellules T CD4+ spécifiques de SHIV sont éliminées de manière préférentielle. Ces résultats pourraient avoir d'importantes implications dans le domaine de la vaccination préventive ou thérapeutique contre le virus du SIDA (collaboration avec Y. Rivière, I.P. ; R. LeGrand, CEA ; B. Moss, NIH).

2) Equipe Patrizia PATRELINI-BRECHOT- Diagnostic des maladies génétiques par l'analyse de la concentration calcique et des cellules fœtales circulantes- Deux nouveaux axes complémentaires de recherche ont débuté 1) l'exploration de la signalisation calcique mitochondriale dans les maladies de la chaîne respiratoire mitochondriale (MCRM); 2) l'étude de l'impact de l'analyse génétique des cellules foetales circulantes (CFC) sur le diagnostic prénatal. 1) Notre objectif est d'évaluer la signalisation calcique au niveau subcellulaire dans des fibroblastes dérivés de patients avec MCRM à l'aide des sondes " aequorine " combinée aux différentes approches: structurales (structure des organelles), fonctionnelles (signal calcique et concentration d'ATP), et génétiques (mutations de l'ADNmit et de l'ADNn) nous permettra d'élucider l'impact réel de l'altération de la signalisation calcique dans le développement de la pathologie mitochondriale. 2) L'intérêt diagnostique du test ISET (Isolation by Size of Epithelial Tumor/Trophoblastic cells) a été démontré chez des femmes à risque d'avoir un enfant avec amyotrophie spinale (SMA). Nous avons validé le test ISET-SMA par l'analyse de 10 CFC par prélèvement maternel chez 4 des 16 femmes du protocole. La faisabilité du test ISET-mucoviscidose a été démontrée (article soumis), et sera suivie de la validation clinique. Le développement du test ISET-trisomie 21 est en cours.

Mots-clés: Virus de l’hépatite C, Virus de l’hepatite B, Calcium, Carcinome Hepatocellulaire, Diagnostic prénatal, cellule fœtale circulante, maladies génétiques



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  LANOY Janine, lanoy@necker.fr

BELGHAZZALI Mbia, gestu807@necker.fr

PATERLINI-BRECHOT Patrizia, PU-PH, (Professeur, Paterlini@necker.fr)

BRECHOT Christian, PU-PH, brechot@necker.fr

BENALI-FURET Naoual, (Post-Doctorant, benali@necker.fr)

CHAMI-MAGGIORA Mounia, (CDD INSERM, chami@necker.fr)

Michel Marie-Louise, INSERM, DR2, maloum@pasteur.fr

KREMSDORF Dina, DR2 INSERM, kremsdor@necker.fr

SOUSSAN Patrick, MCU-PH AP-HP, soussan@necker.fr

MOROSAN Serban-Zaharia, VET,post-Doc,SANOFI, morosan@necker.fr

FAIVRE Jamila MCU-PH, faivre@vlj.inserm.fr

TIERS Valérie, vthiers@pasteur.fr

OULES Benedicte, (Mastère)

DESBENE Cedric, (Mastère)

FETOUCHI Rachid, (Thèse)

MOUAWIA Hussein, (Thèse)

SAKER Ali, (Thèse)

Malmassari Silvina, post-doc (bourse ANRS) smalmass@pasteur.fr

Deng Qiang, post-doc (Bourse MAE) qdeng@pasteur.fr

Bayard Florence, étudiante thèse (bourse ANRS) fbayard@pasteur.fr

Ré Roselyne, étudiante DAA (INAPG) re@pasteur.fr

POL Jonathan, étudiante Thèse pol@necker.fr

HORM Viseth, étudiante DEA, Paris VII, horm@necker.fr

Julie HERVE vétérinaire étudiante en thèse

Bingkai LIU étudiant en thèse

Antonio Sa Cunha chirurgien étudiant en thèse

DESITTER Isabelle, (IE1)

CAZE Magalie, (AI)

TACINE Rachida, (TE)

MAPOULA Aubert, (AGT)

KHAM KHEAN In, (AGT)

Bourgine-Mancini Maryline, Ingénieur de recherche, IP mmancini@pasteur.fr



GARREAU Florianne, IE2 Paris 5, garreau@necker.fr

BREZILLON Nicolas, CDD CE, brezillon@necker.fr

Olivier Brégerie Ingénieur d’étude INSERM

Yannick Valogne Ingénieur d’étude

DOS SANTOS Alexandre , Technicien, ads@pasteur.fr


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