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     Biochimie Structurale - URA 2185 CNRS


  Responsable : ALZARI, Pedro M. (alzari@pasteur.fr)


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Nos travaux de recherche sont orientés vers l'étude de la structure tridimensionnelle de protéines et la spécificité des interactions protéine-ligands par les moyens de la cristallographie des rayons-X, la biochimie des protéines, la microcalorimétrie et la modélisation moléculaire. Nos thèmes de recherche sont focalisés sur l'étude structure-fonction d'enzymes impliquées dans les mécanismes de signalisation cellulaire chez les bactéries, de glycosidases et glycosyltransferases d'importance biomédicale, et de protéines mycobactériennes représentant des nouvelles cibles potentielles pour la chimiothérapie. Les principaux sujets de recherche sont décrits ci-dessous; plus d'information sur l'ensemble de projets de recherche en cours dans le laboratoire est disponible dans notre page Web : http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Bstruct .



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Trans-sialidases de trypanosomes (P.M. Alzari)

Les protozoaires flagellés Trypanosoma cruzi, l'agent causal de la maladie de Chagas dans le continent américain, et T. brucei , l'agent de la maladie du sommeil en Afrique, expriment une trans-sialidase de surface capable de catalyser le transfert d'acide sialique entre différentes glycoprotéines. L'expression de cette enzyme chez T. cruzi est directement liée au pouvoir d'infection du parasite. En collaboration avec les équipes de A.C. Frasch (Argentine) et de S. Withers (Canada), nous avons caractérisé les enzymes homologues de trypanosomatides pathogènes (T. cruzi, T. brucei) et non-pathogènes (T. rangeli) afin de comprendre les bases moléculaires de l'activité de transglycosylation (synthèse de polysaccharides) et de permettre la conception rationnelle d'inhibiteurs pouvant servir à des fins thérapeutiques. Nous avons préalablement déterminé les structures 3D de la sialidase de T. rangeli (Buschiazzo et al, EMBO J., 2000) et de la trans-sialidase de T. cruzi (Buschiazzo et al, Mol. Cell, 2002), et réalisé, à partir de l'information structurale, des études de mutagenèse dirigée des enzymes de T. cruzi (Paris et al, Glycobiol., 2001) et de T. brucei (Montagna et al, Eur. J. Biochem., 2002). Ces études ont montré que les trans-sialidases, à différence des sialidases, présentent un site actif intrinsèquement flexible. La fixation du substrat sialylé déclenche des changements structuraux qui servent à moduler l'affinité pour le substrat accepteur (les mucines chez T. cruzi), créant ainsi les conditions pour une activité de transglycosylation efficace. La comparaison structurale de la trans-sialidase de T. cruzi avec la sialidase de T. rangeli révèle un site catalytique très conservé, au sein duquel des subtiles modifications chimiques et structurales suscitent des changements remarquables dans l'activité catalytique et les propriétés d'inhibition des deux enzymes.

Afin d'élucider le mécanisme catalytique, nous avons réussi à piéger l'état intermédiaire réactionnel en utilisant un substrat activé et à démontrer par des études biochimiques et structurales que la trans-sialidase de T. cruzi et la sialidase de T. rangeli agissent par un mécanisme ping-pong, impliquant la formation d'un complexe covalent sialyl-enzyme avec un résidu tyrosine strictement conservé (Watts et al, J. Am. Chem. Soc, 2003 ; Amaya et al, Structure, 2004 ; Watts et al, J. Biol. Chem., 2005). Ces résultats suggèrent que toutes les sialidases microbiennes utilisent un mécanisme similaire, impliquant la formation d'un complexe intermédiaire glycosyl-enzyme. Par ailleurs, ces travaux démontrent qu'il est possible obtenir des inhibiteurs de sialidases visant directement le mécanisme réactionnel, ouvrant ainsi des nouvelles possibilités pour le développement de composés thérapeutiques.

La proline racemase de Trypanosoma cruzi (P.M. Alzari)

Les racémases catalysent l'isomérisation du carbone-alpha asymétrique des acides aminés et la formation des stéréo-isomères de type D impliqués dans divers processus biologiques comme la formation de la paroi bactérienne. Pour abaisser la barrière énergétique élevée de la réaction d'isomérisation, une première classe de racémases utilisent un co-facteur, le pyridoxal phosphate (PLP), qui acidifie le carbone asymétrique lors de la formation du complexe imine covalent PLP-amino acide, alors qu'une deuxième classe d'enzymes fonctionne sans co-facteur, en utilisant un mécanisme réactionnel dit " à deux bases ". La proline racémase bactérienne a été très étudiée comme système modèle de cette deuxième classe d'enzyme. La proline racémase du parasite humain Trypanosoma cruzi est une enzyme sécrétée qui stimule l'activation polyclonale lymphocytaire de type B et inhibe une réponse immune spécifique de l'hôte. Cette propriété de l'enzyme est indispensable au développement du parasite et à son pouvoir invasif. Les études précédentes avaient suggéré l'existence d'un lien entre l'effet mitogénique de l'enzyme et son activité catalytique, mais la base moléculaire de ce lien restait inconnue.

En collaboration avec le groupe de P. Minoprio à l'institut Pasteur, nous avons mené une étude structurale et thermodynamique de la racémase du trypanosome (Buschiazzo et al, PNAS, 2006). L'enzyme est un homodimère ou chaque monomère est replié en deux sous domaines a/b symétriques séparés par une crevasse profonde. La structure et les propriétés en solution de TcPRACA complexée à un inhibiteur analogue de l'état de transition révèlent la présence d'un centre réactionnel par monomère. Un résultat en contradiction avec le modèle de l'enzyme établi précédemment décrivant un site actif unique par dimère. Dans chaque monomère, deux cystéines sont placées de façon optimale afin d'effectuer une catalyse de type acide/base par un mécanisme impliquant un carbanion stable. La mutation des cystéines catalytiques abolie l'activité enzymatique tout en préservant les propriétés mitogéniques de la protéine. Au contraire, la fixation de l'inhibiteur induit la fermeture de la crevasse entre les sous-domaines et abolie complètement la prolifération des cellules B. Ceci suggèrent que les propriétés mitogéniques de TcPRACA dépendent de l'exposition temporaire d'épitopes de l'enzyme libre.

Protéines kinases et phosphatases mycobactériennes (P.M. Alzari)

La phosphorylation réversible des protéines est la principale modification post-translationelle impliqué dans la signalisation cellulaire des organismes vivants. Chez les bactéries, la plupart des voies de signalisation font intervenir les systèmes à deux composantes impliquant une His-kinase et un receveur, tandis que chez les eucaryotes l'information est acheminée grâce à des Sér-, Thr- ou Tyr-kinases et phosphatases agissant en cascades ou en réseaux. Ces dernières années, cependant, plusieurs gènes codant pour des Sér/Thr/Tyr protéines kinases ou phosphatases ont été identifiés chez différentes procaryotes et le séquençage systématique de génomes bactériens a confirmé ces observations. Ainsi, le génome de Mycobacterium tuberculosis montre la présence de plusieurs Sér/Thr protéines kinases et phosphoprotéines phosphatases probablement impliquées dans la signalisation intracellulaire. En collaboration avec l'équipe de S.T. Cole (IP), nous avons entrepris l'étude de cette famille de protéines mycobactériennes afin de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents et de contribuer au développement des nouveaux outils thérapeutiques.

Nous avons focalisé nos travaux sur deux enzymes de M. tuberculosis, la Ser/Thr protéine kinase PknB et la Ser/Thr phosphatase PstP. Les gènes correspondantes, pknB et pstP, se trouvent dans un opéron très conservé chez les actinobactéries, qui serait impliqué dans le contrôle de la croissance cellulaire. Les domaines catalytiques de PknB et PstP ont été exprimés chez E. coli et les protéines recombinantes purifiées à homogénéité pour des études biochimiques. Les structures 3D ont été déterminées par diffraction des rayons X, démontrant que le repliement des protéines et l'architecture du site actif sont très semblables à ceux des homologues eucaryotes (Ortiz et al, J. Biol. Chem., 2003 ; Wehenkel et al, en préparation). Par ailleurs, nous avons mis en évidence un mécanisme de régulation de l'activité kinase chez M. tuberculosis semblable à celui observé chez les homologues eucaryotes, suggèrant que PknB et PstP jouent un rôle important dans le contrôle de la croissance cellulaire (Boitel et al, Mol. Microbiol., 2003). Nous avons aussi étudié les motifs d'autophosphorylation de PknB et d'autres kinases mycobactériennes, mettant en évidence un pattern de phosphorylation conservé au niveaux de la boucle d'activation (essentiel pour l'activité kinase) et de la région juxta-membrane (possiblement impliqué dans les cascades de signalisation) (Duran et al, BBRC, 2005). D'autre part, nous avons identifié GarA (Rv1827), une protéine à domaine FHA, comme un possible substrat physiologique de PknB. En utilisant une approche protéomique, GarA a été identifiée à partir de extraits protéiques totaux de M. tuberculosis et M. smegmatis (Villarino et al, J. Mol. Biol., 2005). A partir des études physicochimiques et biochimiques, nous avons proposé un modèle de l'interaction PknB-GarA impliquant un mécanisme pour le recrutement des substrats à domaine FHA, qui pourrait être valable pour d'autres kinases mycobactériennes.

Biologie moléculaire structurale: cristallographie et modélisation (Groupe Marc DELARUE)

A. Cristallographie des protéines

1. 6PGL (coll. PT6 et V. Stoven, Bioinformatique Structurale, I.P.) L'affinement de la 6-phosphogluconolactonase (6PGL) de T. brucei a été terminé à 2.1 Angstrom de résolution. Différents jeux de données de diffraction ont été enregistrés sur des cristaux trempés dans des solutions concentrées d'inhibiteurs analogues de substrats, à 2.1 ou 1.9 Å de résolution. Malheureusement, aucune densité supplémentaire n'a été observée dans le site actif. Des co-cristallisations sont en cours pour essayer de visualiser de façon plus précise le site actif.

2. Tdt et Pol mu (N. Expert-Bezancon, F. Romain, coll. F. Rougeon, I.P.) Les tests de cristallisation de la pol mu se poursuivent. De nombreux complexes avec des oligonucléotides de longueur variée ont été soumis à une batterie de conditions de cristallisation. Une autre construction de la pol mu est en train d'être réalisée. Récemment, nous avons construit un modèle de la pol mu en interaction avec un substrat primer-template à partir de la structure de la TdT. Nous postulons (voir Ramsden et coll. Mol. Cell, 2005, 19:357) que le brin template vient se glisser en dessous de la boucle 1, du coté 3' du brin primer et présentant une microhomologie de seulement une paire de base avec le brin primer. Nous pensons que le brin template phosphorylé en 3' a une plus grande affinité avec la pol mu, à cause du Zn++ présent sous la boucle 1. Des simulations de dynamique moléculaire courte ont été effectuées pour valider la stabilité des modèles construits dans différentes conditions. Des expériences sont au cours au laboratoire pour vérifier cette hypothèse.

B. Modes Normaux et Biologie Structurale (E. Lindahl)

Le travail sur les Modes Normaux a été mis en ligne (http://lorentz.immstr.pasteur.fr/norma.php) pour les options suivantes: (1) Modes Normaux et affinement cristallographique. (2) Modes Normaux et affinement des données de microscopie électronique. (3) Modes Normaux et docking de petites molécules. Cette dernière option a fait l'objet d'une publication (NAR) cette année, tandis que l'affinement dans des données de cryo-microscopie a été complètement revu, y compris en tenant compte d'une éventuelle symétrie non-cristallographique. De plus, une collaboration avec le groupe de J.P. Changeux (IP) sur l'application des modes normaux au récepteur nicotinique (pentamérique) a aussi donné lieu à une publication (Biophys. J.).

C. Structure du solvant et électrostatique (C. Azuara)

Un nouveau modèle des interactions protéine-solvant a été mis en ligne en collaboration avec H. Orland (CEA). Il permet de s'affranchir de l'hypothèse de milieux diélectriques continus de valeur constante; la densité du solvant (dipolaire) autour du solute est variable. Différentes options sont disponibles sur le site:

http://lorentz.immstr.pasteur.fr/solvate_mutate.php. Les applications suivantes vont être progressivement mises en place: (1) Incorporation de la polarisabilité de la protéine grâce aux Mode Normaux. (2) Dénaturation de protéines par l'urée en fonction de sa concentration. (3) Etude de la stabilité des protéines dans des solvants organiques.

Mots-clés: biologie structurale, diffraction des rayons X, protéines kinases bactériennes, glycosidases et glycosyl transferases, tuberculose, Trypanosoma cruzi, polymérases, génomique structurale



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  FRAYSSE, Jocelyne, Institut Pasteur (mi-temps), jfraysse@pasteur.fr ALZARI, Pedro M., Professeur IP, alzari@pasteur.fr

ANDRE-LEROUX, Gwénaëlle, CR INRA, gandre@pasteur.fr

BETTON, Jean-Michel, DR2 CNRS, jmbetton@pasteur.fr

BUSCHIAZZO, Alejandro, Chargé de Recherche IP, buschiazzo@pasteur.fr

DELARUE, Marc, DR2 CNRS, delarue@pasteur.fr

ENGLAND, Patrick, Charge de Recherche IP (mi-temps), england@pasteur.fr

PECORARI, Frédéric, CR1 CNRS, pecorari@pasteur.fr

SCHAEFFER, Francis, Chargé de Recherche IP, fschaeff@pasteur.fr

AZUARA, Cyril, étudiant en these, azuara@pasteur.fr

BELLINZONI, Marco, post-doc, mbellin@pasteur.fr

GRANA, Martin, étudiant en thèse, mgrana@pasteur.fr

GUERIN, Marcelo, post-doc, mguerin@pasteur.fr

OPPEZZO, Pablo, post-doc, poppezzo@pasteur.fr

WEHENKEL, Annemarie, étudiante en thèse, wehenkel@pasteur.fr

BELLUNE, Alban, Agent de Laboratoire IP, bellune@pasteur.fr

NGUYEN, Tong, Ingénieur IP, tong@pasteur.fr

ROMAIN, Félix, Ingénieur IP, fromain@pasteur.fr

SASSOON-CLAVIER, Nathalie, Technicienne IP, nsassoon@pasteur.fr

TELLO-MANIGNE, Diana, Ingénieur IP, dtello@pasteur.fr

TOSCAN, Isabelle, Agent de Laboratoire IP, itoscan@pasteur.fr


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