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     Biologie et Pathogénicité fongiques - INRA USC 2019


  Responsable : d’Enfert, Christophe (bpf@pasteur.fr)


  resume

 

Nos travaux ont pour objectif une meilleure compréhension du fonctionnement de la cellule fongique afin d'élaborer des stratégies de contrôle de la croissance chez les champignons pathogènes. Nous nous intéressons plus particulièrement à la levure pathogène Candida albicans dont nous étudions d'une part la diversification génétique naturelle et sa contribution à la virulence, et d'autre part, différents facteurs nécessaires à la formation de biofilms (adhésion, morphogenèse, matrice) et à l'acquisition de leur particularités physiologiques (résistance aux antifongiques). Par ailleurs, nous avons poursuivi l'étude détaillée d'un processus clef dans la biologie des champignons filamenteux, la germination des spores, et une recherche exhaustive de gènes essentiels à la croissance du champignon pathogène Aspergillus fumigatus.



  rapport

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Candida albicans : génomique, biofilms et épidémiologie (M.-E. Bougnoux, M. Chauvel, D. Diogo, A. Firon, S. Goyard, E. Moreno-Ruiz, G. Ortu et C. d'Enfert)

Candida albicans est actuellement le principal pathogène fongique humain. En particulier, C. albicans est responsable d'infections systémiques chez des patients présentant un déficit immunitaire important et recevant une antibiothérapie à large spectre. Les candidoses systémiques sont associées à une forte mortalité malgré la disponibilité de traitements. Il est donc nécessaire de mieux comprendre l'épidémiologie des candidoses et la physio-pathologie de ces infections et de définir de nouvelles cibles thérapeutiques si l'on veut à terme être en mesure de réduire l'incidence et les conséquences de ces infections. Les projets que nous développons s'inscrivent donc à la fois dans une recherche en épidémiologie et dans une étude de processus liés aux infections à l'aide d'outils de génomique.

Une partie de notre activité est consacrée à l'étude in silico des génomes fongiques : curation de la base de donnée génomique de C. albicans, CandidaDB et réannotation du génome de C. albicans ; analyse des génomes de différentes espèces d'Aspergillus, A. nidulans, A. fumigatus, A. oryzae, et plus récemment A. niger, dans le cadre de consortia internationaux.

Par ailleurs, notre groupe coordonne le réseau Marie Curie de recherche et formation Galar Fungail 2 qui étudie les interactions entre Candida albicans et l'hôte à l'aide d'approches génomiques, moléculaires et cellulaires.

a. Formation de biofilms par Candida albicans [M. Chauvel, A. Firon, S. Goyard, E. Moreno-Ruiz et G. Ortu]

Les biofilms sont des communautés de micro-organismes qui se développent en association avec une surface (Photo 1). Ils constituent un environnement protégé au sein duquel les micro-organismes adoptent une physiologie particulière. Dans le cas des levures pathogènes telles Candida albicans, la formation de biofilms a été observée sur différents implants médicaux (prothèses, catheters) et est directement responsable de certaines pathologies (stomatites). Les levures présentes au sein du biofilm développent une résistance accrue aux antifongiques et peuvent donc constituer une source de ré-infection après le traitement apparemment efficace d'une candidémie. Etant donnée l'importance croissante des infections à Candida en santé humaine et la mortalité importante qui leur est associée, une meilleure compréhension de la formation des biofilms en vue de développer des moyens de détection ou de prévention s'avère nécessaire.

L'étude comparative des transcriptomes de cultures planctoniques et de biofilms de C. albicans nous avait permis d'identifier un grand nombre de gènes dont l'expression est augmentée dans les biofilms. Nos travaux actuels ont pour objectif d'évaluer le rôle de plusieurs de ces gènes dans la formation de biofilms par construction et analyse de souches présentant des mutations nulles pour l'un ou l'autre de ces gènes. L'inactivation de 48 de ces gènes a été entreprise et la caractérisation phénotypique des souches mutantes obtenues a été poursuivie en 2005. L'étude de ces souches montre que la capacité de C. albicans a former des hyphes est un déterminant important de la formation de biofilms. De plus, certains mutants restent capables de former un biofilm dont la cohésion est altérée, indiquant un rôle possible de certains des gènes mutés dans la production de la matrice extracellulaire du biofilm. La caractérisation détaillée des gènes dont l'inactivation a pour conséquence un altération de la structure du biofilm est actuellement poursuivie.

G. Janbon et I. Iraqui dans l'Unité de Mycologie Moléculaire ont montré que la kinase Yak1 régule la formation de biofilm par Candida glabrata, du fait du contrôle qu'elle exerce sur le silencing télomérique et l'expression de certaines adhésines. Nous avons poursuivi ce travail en étudiant le rôle de la kinase Yak1 chez C. albicans. Nos résultats montrent que cette kinase est impliquée dans le contrôle de la différentiation hyphale et par conséquent dans la formation de biofilm. Nous poursuivons actuellement la caractérisation de Yak1 dans le cadre d'un Programme Transversal de Recherche impliquant outre l'Unité de Mycologie Moléculaire, l'Unité de Chimie Organique, l'Unité de Biochimie Structurale et la Plate-forme Production de Protéines Recombinantes et Anticorps de Pasteur Génopole® Ile-de-France. Par ailleurs, nous tentons d'identifier les cibles de Yak1 par une approche protéomique en collaboration avec la Plate-forme de Protéomique.

b. Diversité moléculaire de C. albicans [M.-E. Bougnoux, D. Diogo et C. d'Enfert]

La technique de Multi Locus Sequence Typing (MLST) mise au point dans notre laboratoire permet un typage reproductible et extrêmement discriminant des souches de C. albicans. Cette méthode est basée sur le séquençage de six ou sept loci indépendants qui présentent des variations intra-spécifiques. Un des avantages du typage par MLST réside dans la possibilité d'échange des données produites dans différents laboratoires. Ces échanges sont facilités par l'existence d'une base publique pour les données de typage de C. albicans par MLST (http://calbican.mlst.net) que nous entretenons en collaboration avec le groupe de B. Spratt (Imperial College, Londres).

La technique de MLST a été appliquée à l'étude de différentes collections de souches infectieuses et commensales avec l'aide de la Plate-forme Génomique de Pasteur Génopole® Ile-de-France. Nos résultats indiquent à la fois des évènements de micro-évolution par perte d'hétérozygotie au sein des différents groupes clonaux qui constituent l'espèce C. albicans et des évènements probables de sexualité entre isolats de groupes clonaux différents. Le maintien d'un fort taux d'hétérozygotie au sein de la population de C. albicans suggère que les évènements de perte d'hétérozygotie sont contre-sélectionnés dans l'environnement, hypothèse que nous tenterons de valider. De façon remarquable, l'application de la technique de MLST à des isolats commensaux nous a permis de détecter des souches reliées par des phénomènes de micro-évolution soit chez un même individu, soit chez des individus issus d'une même famille. Ceci suggère une évolution rapide de l'espèce lors de la colonisation du tractus gastro-intestinal. La nature exacte et l'ampleur de ces micro-évolutions est en cours de détermination.

Germination des spores chez Aspergillus nidulans (A. Lafon et C. d'Enfert)

Les champignons filamenteux du genre Aspergillus sont connus tant pour leurs applications biotechnologiques que pour les pathologies dont ils sont responsables. La germination des spores (conidies) représente une étape clef dans le cycle de développement du champignon et constitue la première étape dans la colonisation d'un nouvel environnement. Les recherches effectuées visent à caractériser les évènements moléculaires et biochimiques intervenant au cours des phases précoces de la germination et en particulier la compréhension du signal déclenchant le processus germinatif et sa transduction au niveau cellulaire.

Nos travaux ont eu pour objectif de mieux comprendre les mécanismes de régulation de l'adénylate cyclase et de la protéine kinase AMPc-dépendante lors de l'initiation de la germination. Une analyse in silico des génomes de A. nidulans, A. fumigatus et A. oryzae nous a permis de montrer l'existence d'une diversité notable de récepteurs transmembranaires putatifs couplés aux protéines G (entre 13 et 16 selon l'espèce), comparable à celle observée chez d'autres ascomycètes filamenteux mais plus importante que celle décrite chez les levures. Les composants de la signalisation agissant en aval des GPCRs - protéines G hétérotrimériques, adénylate cyclase, etc… - sont par contre très conservés en structure et en nombre. Cette observation reflète probablement une adaptation des champignons filamenteux à des niches écologiques variées et leur capacité à intégrer des stimuli externes divers via des processus cellulaires convergents. Nous avons par ailleurs montré qu'une seule des trois sous-unités Gα de A. nidulans, GanB, intervient dans le contrôle des étapes précoces de la germination. GanB contrôle la production d'AMPc lors de l'induction de la germination et cette fonction de GanB nécessite les protéines SfaD/Gβ et GpgA/Gγ(Collaboration J. Yu, U. Wisconsin, USA). Enfin, nous avons achevé la caractérisation de la sous-unité régulatrice de la protéine kinase AMPc-dépendante de A  nidulans, désignée PkaR et démontré son rôle de régulateur pléiotrope dans le développement du champignon, en particulier au niveau de la germination, de la croissance hyphale et de la reproduction asexuée.

Identification de gènes essentiels chez le champignon pathogène Aspergillus fumigatus (L. Simon, M. Lecomte et C. d'Enfert)

Aspergillus fumigatus est actuellement le principal champignon filamenteux pathogène de l'homme, responsable d'infections systémiques fatales (aspergillose invasive) chez le patient immuno-déprimé, infections pour lesquelles on ne dispose pas de traitement à la fois efficace et avec peu d'effets secondaires. Les approches de génétique réverse ciblées sur différentes protéines dont on pouvait postuler une implication dans le processus infectieux ne s'étant pas révélées fructueuses, il nous a semblé nécessaire de développer de nouvelles stratégies plus exhaustives permettant l'identification de gènes essentiels à la croissance du champignon. Nous avions ainsi mis au point une méthode d'identification de gènes essentiels chez A. fumigatus couplant mutagenèse insertionnelle par un transposon sur des souches diploïdes et haploïdisation par génétique parasexuelle. Cette méthode désormais automatisée sur certaines de ses étapes nous a permis de démarrer un programme d'identification systématique des gènes essentiels de A. fumigatus.

Légende :

Photo 1 : Biofilm de Candida albicans formé sur un support plastique. Les cellules formant le biofilm sont incluses dans une matrice extracellulaire (Microscopie électronique à balayage ; collaboration Adeline Mallet et Marie-Christine Prévost, Plate-forme de Microscopie électronique)

Mots-clés: Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, AMPc, kinase, transduction du signal, germination, spore, conidie, antifongique, cible, transposon, puce à ADN, biofilm, épidémiologie, Multi-Locus Sequence Typing, génomique, transcriptome



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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Dugast, Christine (cdugast@pasteur.fr) Bougnoux, Marie-Elisabeth, Université Paris V (Maître de Conférence/Praticien Hospitalier, bougnoux@pasteur.fr)

d’Enfert, Christophe, Institut Pasteur (Chef de Laboratoire, denfert@pasteur.fr)

Goyard Sophie, Institut Pasteur (Chargée de recherche, goyard@pasteur.fr)

Arsenault, Geneviève (Master 1, Université Laval, Canada)

Diogo, Dorothée (Etudiante en thèse, ddiogo@pasteur.fr)

Firon, Arnaud (Stagiaire post-doctoral, afiron@pasteur.fr)

Lafon, Anne (Etudiante en thèse, alafon@pasteur.fr)

Moreno-Ruiz, Emilia (Stagiaire post-doctorale, emorrui@pasteur.fr)

Ortu, Giuseppe (Etudiant en thèse, Université de Sassari, Italie)

Simon, Laurence (Stagiaire post-doctorale)

Chauvel, Murielle (technicienne, mchauvel@pasteur.fr)

Lecomte, Maud (technicienne, mlecomte@pasteur.fr)


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