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     Biologie Moléculaire du Développement


  Responsable : Jean-François Nicolas (jfnicola@pasteur.fr)


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Le thème central de l'unité est celui du comportement (en particulier des mouvements) et des stratégies cellulaires mis en œuvre au cours du développement des mammifères. Les mouvements des cellules et les stratégies développementales basées sur un patterning génétique sont l'apanage des développements élaborés (vertébrés, arthropodes). Par contre, le développement de la plupart des invertébrés repose sur des interactions entre cellules voisines qui permettent, avant tout mouvement, la spécification des types cellulaires. La transition entre ces développements élaborés et ceux des invertébrés soulève des questions complexes. En effet, les mouvements peuvent détruire les interactions entre cellules qui sont largement utilisées chez les invertébrés pour leur spécification. Il est donc probable que l'évolution des développements des invertébrés aux vertébrés s'est accompagnée d'un changement de logique. Pour examiner cette question, il faut (1) connaître les mouvements et le comportement des cellules de l'embryon d'un invertébré chordé actuel, l'amphioxus ; (2) connaître les mouvements et les stratégies développementales qu'utilise l'embryon de la souris ; (3) comparer certains aspects du développement de la souris, du poisson-zèbre et de l'amphioxus.



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Méthodes et systèmes modèles

En conséquence, l'unité développe des méthodes d'analyse de comportement des cellules dans plusieurs systèmes modèles : la souris, le poulet, le poisson-zèbre et l'amphioxus.

Cette année, les deux méthodes nouvelles d'analyse clonale, sur lesquelles nous travaillons depuis quelque temps pour complémenter la méthode LaacZ ciblée à un tissu, ont été validées chez la souris.

Dans la première méthode (méthode LaacZ ubiquiste), l'expression du gène rapporteur LaacZ n'est pas ciblée à un tissu. Toutes les cellules des clones sont donc détectées, ce qui permet d'aborder outre les questions du comportement des cellules, celles de leurs potentialités.

Dans la seconde méthode (système d'induction temporelle de clones), le moment où le marquage clonal est déclenché est contrôlé. On peut donc obtenir une représentation clonale à saturation de tout moment du développement (et ce dès le début de la gastrulation). Selon le montage génétique utilisé, on peut cibler ou non les cellules dans lesquelles le marquage clonal est déclenché. Selon le gène rapporteur utilisé, on peut favoriser l'analyse topographique globale à un moment précis du développement (rapporteur LacZ) ou le suivi en continu des cellules in vivo (rapporteur EGFP). Cette dernière possibilité nous conduit à établir l'imagerie statique 3D et dynamique 4D des embryons avec une définition cellulaire. L'imagerie dynamique 4D sera aussi utilisée pour un suivi du développement de la souris, du poisson-zèbre et de l'amphioxus. Les reconstructions 4D réalisées sur une période de temps suffisamment longue, permettraient l'analyse clonale in silico de toutes les cellules d'un même embryon. Elles nous renseigneraient aussi sur les changements de forme des cellules qui accompagnent presque toutes les transitions développementales.

Les problèmes biologiques

Les problèmes biologiques qui nous ont retenus cette année concernent les comportements des cellules a) au cours de la période de l'élongation de l'embryon durant laquelle les organes sont positionnés selon les axes AP et DV (ectoderme de surface, tube neural et mésoderme) ; b) durant l'élaboration de structures tridimensionnelles particulières : les couches des neurones produits par la zone ventriculaire et les feuillets épithéliaux produits par les cellules souches du follicule pileux (FP). Les comportements des cellules que nous avons mis en évidence jouent un rôle moteur dans l'émergence de la forme des structures.

1. L'exploitation du système clonal LaacZ ubiquiste et du système d'induction temporel de clones ciblés à une population de cellules particulières, ici celle qui exprime Brachyury (les cellules de la ligne primitive et du bourgeon de queue) (Fig.1) nous a permis de préciser les modes de division (successivement souche et prolifératif) et les potentialités des cellules impliquées.

2. Des analyses plus fines de l'élongation de la moelle épinière chez le poulet et de l'ectoderme de surface chez la souris ont révélé les rôles successifs de la dispersion des cellules, de la convergence et de l'intercalation. Un rôle important est aussi joué par des modes de croissance des cellules et l'orientation des divisions (Fig.2).

3. Enfin, plus tardivement, après l'individualisation du neuro-épithélium et de l'ectoderme de surface, nous avons pu montrer (chez le poulet) par la microscopie confocale " time-lapse " que le maintien de l'orientation du fuseau mitotique parallèlement au plan du neuro-épithélium nécessite RhoA. On sait par ailleurs que l'orientation du plan de division contrôle le destin de ces cellules par l'intermédiaire d'une répartition asymétrique ou non de certains de leurs constituants.

4. L'étude approfondie du renouvellement des FP à l'aide du système d'induction temporelle de clones nous a permis de mettre en évidence l'existence d'une couche de cellules particulières de la matrice qui borde la papille dermique. Les cellules qui la constituent se divisent selon un mode de type souche et d'une manière stéréotypée (Fig. 3). Cette analyse révèle aussi qu'elles se divisent selon des plans en relation avec leur position proximo-distale. Les cellules produites par cette couche germinative sont sujettes à un processus d'intercalation et à un positionnement dans une colonne clonale particulière. Ces trois facteurs sont déterminants pour l'émergence de la forme du FP. Les relations entre le choix des destins des cellules (types de cellules différenciées produites) et le contrôle des opérations cellulaires ont pu être précisées. Leur découplage qui exploite la géométrie de la matrice pourrait représenter un exemple d'une stratégie générale des développements visant à simplifier l'organisation génétique des opérations morphogénétiques.

Légendes des photos :

Figure 1 : Le système d'induction temporel de clones. Un agent chimique sert à induire une recombinaison génétique qui active l'expression d'un gène rapporteur LacZ. Ici, le système d'induction a été ciblé à des cellules de la ligne primitive (induction à E7,5 et E8,5) et du bourgeon de queue (induction à E10,5). La contribution de ces cellules est révélée par un marquage LacZ dans des embryons à E12,5. Les têtes de flèches indiquent la limite rostrale de cette contribution. Photo E. Tzouanacou, (collaboration avec V. Wilson, Edimbourg, Ecosse).

Figure 2 : Comportement des cellules dans l'ectoderme de surface. Ce marquage clonal révèle que les cellules de cette structure passent d'abord par une phase de dispersion (intercalation) qui les dispose tout le long de l'axe AP de l'embryon puis, plus tardivement, par une phase de croissance orientée locale (par exemple, médio-latéralement dans le tronc). Embryon à E14,5, marquage LacZ. Photo A.C. Petit.

Figure 3 : Comportement des cellules dans la matrice du follicule pileux. (A) Les contours des cellules ont été dessinés à partir d'une section optique d'un FP d'une souris transgénique dans laquelle la GFP est adressée aux membranes (A. Medvinsky, Edimbourg, Ecosse). Les comportements des cellules de la matrice sont organisés selon la dimension radiaire. Les cellules-souches (couleurs les plus foncées) forment une couche germinative accolée à la papille dermique. Elles s'auto-renouvellent et produisent des progéniteurs transitoires qui constituent la deuxième couche (couleurs claires). Le destin des cellules est en relation avec leur position le long de l'axe proximo-distal. (B) Hiérarchie clonale dans la matrice. Photo E. Legué.

Mots-clés: LaacZ, lignage cellulaire, embryon de souris, analyse clonale, système nerveux central, follicule pileux, Amphioxus, poisson-zèbre, biologie du développement



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  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Françoise Kamel – fkamel@pasteur.fr Jean-François Nicolas, INSERM (DR1, jfnicola@pasteur.fr)

Estelle Hirsinger, CNRS (CR2, ehirsing@pasteur.fr)

Luc Mathis, CNRS (CR1, lmathis@pasteur.fr)

Elena Tzouanacou, stagiaire post-doctorale (elena@pasteur.fr)

Emilie Legué, stagiaire post-doctorale (elegue@pasteur.fr)

Isabelle Roszko, stagiaire de doctorat (iroszko@pasteur.fr)

Anne-Cécile Petit, stagiaire de doctorat (acpetit@pasteur.fr)

Inês Sequeira, stagiaire de doctorat (sequeira@pasteur.fr)

Morgane Dixsaut, stagiaire Master 2ème année (mdixsaut@pasteur.fr)

Christine Mariette, technicienne supérieure IP (mariette@pasteur.fr)

Suzanne Capgras, technicienne supérieure, IP (scapgras@pasteur.fr)

Pascal Dardenne, technicien animalier, IP (pdardenne@pasteur.fr)

Claude Mourier, aide de laboratoire, IP (cmourier@pasteur.fr)

Françoise Kamel, secrétaire, IP (fkamel@pasteur.fr)


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