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     Biologie cellulaire du parasitisme - INSERM U 786


  Responsable : Nancy Guillén-Aghion (nguillen@pasteur.fr)


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L'amibe hématophage, Entamoeba histolytica est l'agent étiologique de l'amibiase, une maladie infectieuse intestinale responsable de 50 millions de cas cliniques et de près de 100 000 décès par an. Le parasite résidant dans le colon est doué de mobilité, il envahit et détruit l'épithélium intestinal humain et forme des abcès hépatiques. L'objectif général de notre projet de recherche est d'élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués d'une part dans le mouvement de E. histolytica, et d'autre part dans son interaction avec les cellules humaines



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Durant l'invasion des tissus par E. histolytica, deux processus majeurs sont connus : (i) la mobilité amibienne qui nécessite une interaction avec le substrat (ex.: matrice extracellulaire) et une réorganisation du cytosquelette amibien ; (ii) l'adhérence aux cellules humaines qui résulte de l'activation des récepteurs de surface amibiens, de ceux de la cellule hôte et des réarrangement de leur cytosquelette. Nos principales découvertes ces dernières années ont mis en évidence le rôle crucial de la mobilité et de l'adhérence dans l'établissement de l'infection amibienne. L'analyse de ces deux fonctions et de leur impact dans la pathogenèse est réalisée selon les objectif suivants :

1. Elucider les remaniements du cytosquelette nécessaires à la motilité ainsi que les voies de signalisation activées par les interactions entre le parasite et son environnement extérieur.

2. Identifier les molécules de surface nécessaires à l'interaction entre l'amibe et les cellules humaines.

3. Etablir le rôle de ces molécules dans (i) le dialogue entre l'amibe et ces cellules et (ii) le processus de phagocytose.

4. Analyser l'amibiase par une approche physiopathologique et par le développement de biotechnologies.

Ces dernières années, notre recherche pluridisciplinaire sur E. histolytica et sur l'amibiase, nous a permis d'obtenir des outils appropriés (souches, puces à ADN, ARNi, banque de données …) permettant une approche innovante et globale dans la compréhension de l'amibiase. Les techniques les plus innovantes que nous utilisons actuellement sont la génomique, la protéomique et l'imagerie. Grâce à la performance de ces technologies, nous avons obtenu de nouvelles connaissances sur le processus infectieux de E. histolytica et nous avons ouvert la voie à une meilleure compréhension de l'amibiase. Durant cette dernière année, nos principales découvertes ont été les suivantes :

1. Analyse de l'expression de gènes impliqués dans le processus pathogène de Entamoeba histolytica

C. Weber, J. Santi-Rocca, L-B. Luong-Nguyen, Genopole® Ile-de-France (PF2, PF4 et PF8), D. Mirelman (Weizmann Institute, Rehovot, Israël) et M-C. Rigothier (Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry). Projet soutenu par Pasteur-Weizmann Research Council.

- Identification de gènes régulés en fonction des conditions de culture et analyse de leur expression par microarrays

Une biopuce spécifique a été développée en utilisant 1300 oligonucléotides de séquences uniques de E. histolytica. Cette biopuce a été validée par une expérience de choc thermique. Les résultats montrent : (i) des régulations spécifiques pour des gènes induits lors d'un tel stress et (ii) l'expression différentielle de copies d'un même gène, pour des gènes impliqués dans la virulence, dont celui codant pour la grande sous-unité de la Gal/GalNAc lectine. La comparaison des profils d'expression génétique de parasites virulents purifiés d'abcès hépatiques de hamsters et d'amibes ayant perdu leur pouvoir pathogène a été réalisée. Une nouvelle famille de facteurs pathogènes a été identifiée. L'ensemble des résultats obtenu par l'analyse de biopuces a été groupé dans une base de données développée à l'Institut Pasteur et les résultats obtenus sont en cours de validation.

- Analyse de la cinétique d'expression de gènes cibles lors du processus pathogène

Afin de confirmer les données obtenues par l'analyse des microarrays, une méthode d'analyse de l'expression génétique lors du processus infectieux a été développée. L'utilisation d'un modèle d'infection hépatique chez le hamster et de la technique de PCR en temps réel (utilisant des " molecular beacons " comme sondes de sensibilité et de spécificité accrues) a permis de quantifier des ARNm faiblement exprimés pendant l'infection.

Cette méthode a été mise au point en utilisant kerp1, gène impliqué dans le processus pathogène de E. histolytica. Ainsi, nous avons déterminé le profil d'expression de kerp1 en fonction du temps d'infection. Nous avons de plus comparé la quantité de la protéine KERP1 par immunohistochimie au cours de l'infection hépatique. Enfin, la stratégie d'ARN antisens nous a permis de confirmer le rôle capital de kerp1 dans la formation de l'abcès amibien.

2. Analyse des effets du TNF sur E. histolytica et l'amibiase

E. Labruyère, S. Blazquez et C. Weber avec: G. Guigon, O. Sismeiro et J-Y Coppée (Génopole de l'Institut Pasteur), P. Roux (Plateforme d'Imagerie Dynamique), P. Ave (unité de Recherche et d'Expertise Histologie et Pathologie) et M.C. Rigothier (Faculté de Pharmacie, Chatenay-Malabry). Projet soutenu par le PTR 178.

Le TNF pourrait avoir un double rôle lors de l'amibiase : dans la réaction inflammatoire développée par l'hôte et sur la motilité du trophozoïte (nous avons montré que le TNF est chimioattractant et chimiocinétique pour E. histolytica). Lors de la formation de l'abcès hépatique chez le hamster, nous avons mis en évidence un afflux de macrophages et la présence de TNF dans le lumen des vaisseaux et autour des foyers inflammatoires. En revanche, après infection par un transfectant déficient dans l'adhésion, la réaction inflammatoire est retardée et réduite, suggérant que l'adhérence aux cellules cibles et la signalisation induite sont nécessaires pour la mise en place de la réponse inflammatoire. La modulation de l'expression génique d'E.histolytica, induite par le TNF a été étudiée à l'aide de puces à ADN, construites dans le laboratoire. Les résultats indiquent une surexpression de gènes codant des protéines du cytosquelette, des protéines ribosomales et un facteur de transcription. Le rôle de certaines de ces protéines sera analysé. Afin d'étudier la physiopathologie d'E. histolytica, nous développons un modèle " ex-vivo " d'explant de colon humain. Les premières étapes du processus d'invasion de ces explants, par les trophozoïtes, présentent les caractéristiques décrites de l'amibiase intestinale humaine. La signature des structures autofluorescentes du colon humain, en absence et en présence d'E. histolytica, a été déterminée. A l'aide de ce modèle, nous souhaitons décortiquer les mécanismes moléculaires des premières étapes de l'amibiase intestinale.

3 - La Myosine IB de E. histolytica est un facteur régulant la dynamique du cytosquelette d'actine et la formation de pseudopodes pendant la phagocytose

S. Marion avec C. Laurent, Genopole® Ile-de-France, IP). Projet PHAGOAMEBA, Union Européenne - INCO-DEV.

Le parasite a adapté, de façon remarquable, son cytosquelette riche en actine à (i) la motilité (ii) l'infection (iii) son action cytolytique et (iv) la phagocytose des cellules humaines. Une analyse protéomique à haute résolution par LC/MS-MS des phagosomes a donné la première vue d'ensemble de leur composition, révélant des composants cytosquelettiques ainsi que des molécules de signalisation. Un homologue de CARMIL, qui interagit avec la myosine IB a été decouvert et deux protéines d'intérêt par leur rôle potentiel dans la dynamique de phagosomes : α-actinine et formine.

Figure 1 :Tissu de colon humain (A) Coupe histologique (longitudinale) de la muqueuse et de la sous-muqueuse d'un explant de colon humain (coloration à l'hématoxyline et à l'éosine). (B) Autofluoresence de la muqueuse du colon humain en imagerie multiphotonique (empilement des images transversales). Sur les deux images sont reconnaissables les cryptes de Lieberkühn, l'épithélium et le chorion.

Figure 2. Protéines identifiées dans la composition du phagosome précoce de Entamoeba histolytica.

Les phagosomes sont isolés de la souche sauvage et de la souche surexprimant la myosine IB, les protéines purifiées sont identifiées par chromatographie liquide et spectromètrie de masse. Des protéines spécifiques de signalisation ont été idéntifées ainsi que de facteurs majeurs régulant l'activité du cytosquelette.

Mots-clés: Amibiase, Entamoeba, mobilité, phagocytosis, microarrays, proteomique



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  LAMBRECHT, Marie-Régine, Secrétaire, I.P. lambrech@pasteur.fr GUILLEN-AGHION, Nancy, Directeur de recherche CNRS. nguillen@pasteur.fr

LABRUYERE-DADAGLIO, Elisabeth, Chargée de Recherche, I.P. elabruye@pasteur.fr

SOLIS, Carlos, post-doctorant, boursier FRM, csolis@pasteur.fr

BLAZQUEZ, Samantha, Etudiante en thèse, blazquez@pasteur.fr

SANTI-ROCCA, Julien, Etudiant en Thèse, jsanti@pasteur.fr

LUONG NGUYEN, Liem, Etudiant Master

PRENDKI, Virginie, Médecin, Etudiante Master

WEBER, Christian, Ingénieur, I.P. cweber@pasteur.fr

LAMBRECHT, Marie-Régine, Secrétaire, I.P., lambrech@pasteur.fr


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