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     Biologie des bactéries pathogènes à Gram-positif


  Responsable : Patrick TRIEU-CUOT (ptrieu@pasteur.fr)


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Notre activité de recherche a pour but l'élucidation des bases moléculaires de la virulence des bactéries à Gram positif à bas G+C%. En effet, une compréhension approfondie de la physiopathologie du processus infectieux doit permettre le développement de nouvelles thérapeutiques et/ou d'outils diagnostics innovants pour le traitement, la prévention ou le contrôle des infections dues à ces bactéries. Nous avons choisi Staphylococcus aureus et Streptococcus agalactiae comme modèles de bactéries pathogènes humaines à multiplication extracellulaire, et Listeria monocytogenes comme modèle de bactérie pathogène à multiplication intracellulaire.

Nos principaux thèmes de recherche sont: 1) structures des surfaces bactériennes (acides lipotéichoïques et protéines de surface) impliquées dans les interactions avec l'hôte, 2) adaptation métabolique et virulence, et 3) régulation génétique et expression des gènes de virulence en relation avec la réponse au stress et l'adaptation environnementale (système de régulation à 2 composants).



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Composants de la surface bactérienne impliqués dans la virulence

L'analyse des gènes codant pour des sortases à partir des banques génomiques de bactéries à Gram-positif nous a conduit à proposer l'existence de 4 classes de sortases appelées A, B, C, et D (Dramsi et al., 2005). Une analyse in silico du génome de la souche S. agalactiae (streptocoque du groupe B, SGB) NEM316 a montré qu'elle codait pour 5 sortases putatives, dont la sortase majeure SrtA et quatre sortases accessoires de classe C. Nous avions préalablement caractérisé le rôle de SrtA qui ancre au peptidoglycane la plupart sinon toutes les protéines LPXTG (n = 35) codées par NEM316 (Lalioui et al., 2005). Plus récemment, nous avons montré que les gènes des sortases C des SGB étaient groupés par paires en 2 loci distincts, srtC1-C2 and srtC3-C4, possédant une organisation génétique similaire et vraisemblablement impliqués dans la biosynthèse de pili. Chaque paire de gènes srtC est flanquée de gènes codant pour des protéines LPXTG, 2 gènes amont et un gène aval, et cet opéron putatif contient à son extrémité 5' un régulateur transcriptionnel divergent. Nous avons montré que NEM316 n'exprime que le locus srtC3-C4 qui code pour 3 protéines de surface (Gbs1474, Gbs1477 et Gbs1478) qui polymérisent pour former des appendices ressemblant à des pili. L'analyse structurale et fonctionnelle de ce locus a révélé que: 1) le régulateur rogB était nécessaire à l'expression de l'opéron srtC3-C4; 2) Gbs1477 et soit SrtC3 ou SrtC4 étaient nécessaires à la biosynthèse des pili; et 3) les pili de NEM316 étaient composés d'au-moins 3 protéines LPXTG, Gbs1477, Gbs1474, et Gbs1478. Gbs1477 constitue le composant majeure du pilus (Figure 1) alors que Gbs1474, un composant mineur, ancre vraisemblablement le pilus au peptidoglycane et que Gbs1478 doit être une adhésine. Nous avons également montré que la biosynthèse des pili était un processus structuralement tolérant car des structures piliées peuvent être formées en absence de la sous-unité protéique basale (Gbs1474) ou de l'adhésine (Gbs1478). Cette étude ouvre de nouvelles perspectives pour l'étude des interactions bactérie-hôte chez les streptocoques pathogènes.

Adaptation métabolique et virulence

A ce jour, 3 stratégies utilisées par les SGB pour tolérer l'oxygène environnementale ou la présence de de formes réactives de l'oxygène (FRO) ont été génétiquement et biochimiquement caractérisées: 1) la détoxification des FRO est essentiellement catalysée par la superoxide dismutase manganèse-dépendante (Mn-SodA) et nous avons préalablement montré qu'un mutant sodA de NEM316 possédait une sensibilité accrue à la phagocytose par les macrophages et était rapidement éliminé du sang de souris infectées par voie intraveineuse; 2) la protection contre les FRO implique le pigment caroténoïde spécifique des SGB qui constitue une barrière physique de surface et contribue à la survie de la bactérie dans le phagolysosome des macrophages (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101-14491); 3) comme tous les streptocoques pathogènes, les SGB sont considérés être des bactéries fermentaires productrices d'acide lactique et aérotolérantes. Cependant, nous avons démontré que les SGB pouvaient développer un métabolisme respiratoire en présence de 2 éléments essentiels, ménaquinone (vitamine K) et hème, qui sont présents chez l'animal hôte. Ces composants activent une chaîne de transport d'électrons qui utilise la cytochrome bd quinol oxidase comme oxydoréductase terminale. Le métabolisme respiratoire améliore considérablement la croissance des SGB et permet d'éliminer l'oxygène de l'environment. Un mutant incapable de respirer présente une croissance altérée dans le sang humain et une diminution de virulence dans le modèle du rat nouveau-né. Ces résultats suggèrent que le métabolisme respiratoire des SGB facilite leur dissémination et contribue à leur virulence en favorisant leur survie dans le sang.

Régulation génique et réponse au stress

Chez L. monocytogenes, le gène degU code pour un régulateur orphelin car son génome ne possède pas d'orthologue du gène degS codant l'histidine kinase normalement associée à ce régulateur (système DegS/DegU) et ne code pas pour des histidines kinases orphelines. Une diminution significative (1 log) de la DL50 du mutant ÆdegU, par rapport à la souche sauvage EGDe, a été observée dans un modèle d'infection murin. DegU contrôle négativement sa propre synthèse chez L. monocytogenes, à l'inverse de la situation chez Bsubtilis et est essentiel pour la motilité à 25°C. En effet DegU est requis pour l'expression de plusieurs gènes de motilité et chimiotaxie, dont les gènes flaA et motAB qui sont exprimés à 25°C mais pas à 37°C. De plus, DegU est nécessaire pour la formation efficace de biofilms bactériens par Listeria monocytogenes (adhérence aux surfaces inertes en polystyrène). Nous avons inactivé le site de phosphorylation de DegU in vivo et montré que la protéine retient la plupart de son activité, indiquant que la forme non-phosphorylée est active.

Le système à deux-composants YycG/YycF est très fortement conservé et spécifique des bactéries Gram-positives à bas GC %, comprenant plusieurs pathogènes (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Listeria monocytogenes). Ce système est essentiel à la viabilité cellulaire, mais les bases moléculaires de ce phénotype et la nature du régulon YycF restaient à identifier. La définition d'une séquence de reconnaissance potentielle pour le régulateur YycF nous a permis d'identifier des membres probables du régulon YycF chez Staphylococcus aureus. Pour tester nos prédictions, nous avons placé l'opéron yycF de S. aureus sous le contrôle d'un promoteur inductible, et confirmé que ce système est essentiel pour la viabilité cellulaire. Les protéines YycG et YycF de S. aureus ont été surproduites chez E. coli et purifiées. L'autophosphorylation de la kinase YycG et le phosphotransfert vers YycF ont été montrés in vitro. Des expériences de retard de migration sur gel et d'empreinte à la DNaseI ont permis de montrer la fixation directe in vitro de la protéine purifiée YycF aux régions promotrices des gènes ssaA and isaA, codant des antigènes potentiels de surface, ainsi que du gène lytM codant une peptidoglycane hydrolase.

Plus récemment, nous avons utilisé la microscopie à fluorescence pour montrer la perte de la viabilité cellulaire en l'absence de YycG/YycF, et montré à l'aide de PCR en temps réel que le système contrôle positivement l'expression des gènes ssaA, isaA et lytM, ainsi que de plusieurs gènes de virulence potentiels dont la région promotrice contient un site de fixation prédit pour YycF. Enfin, nous avons montré une relation directe entre la quantité de YycF dans la cellule et l'adhérence des bactéries aux surfaces inertes en polystyrène, c'est à dire la capacité à former des biofilms.

La protéase ATP-dépendante Clp de B. subtilis joue un rôle central dans le réseau de transmission de signaux contrôlant les réponses de phase stationnaire telles que la compétence, la synthèse d'enzymes dégradatifs, la réponse aux stress et la sporulation. Nous avions préalablement décrit le mutant clpP de B. subtilis comme étant non-mobile avec une morphologie hautement filamenteuse, avec une croissance en tant que longues chaines de cellules allongées pendant la phase exponentielle. Ceci nous a conduit à l'hypothèse selon laquelle l'expression de gènes de chimiotaxie, motilité, et/ou d'autolysines, dont la plupart sont dépendants du facteur sigma alternatif sigma D, pourrait être affectée dans le mutant clpP. En effet les mutants clpP et sigD de B. subtilis présentent des phénotypes très similaires: la ségrégation chromosomique et la septation ont lieu normalement, mais les cellules présentent un défaut de séparation, suggérant que l'expression d'une autolysine spécifique sigma D-dépendante pourrait être affectée dans le mutant clpP (Figure 2). Parmi ceux-ci, l'autolysine majeure LytF joue un rôle important dans la séparation des cellules. Nous avons montré que lytF n'est pas exprimé dans le mutant clpP. En plaçant le gène lytF sous le contrôle d'un promoteur inductible sigma D-indépendant, nous avons pu montrer que des concentrations croissantes de LytF dans la cellule conduisent à la réversion progressive du phénotype filamenteux du mutant clpP. L'activité de sigma D, et ainsi de lytF, est contrôlée par le facteur anti-sigma FlgM chez B. subtilis. Effectivement, une mutation flgM réverse complètement le phénotype filamenteux du mutant clpP, suggérant que le facteur anti-sigma FlgM pourrait être spécifiquement dégradé par la protéase ATP-dépendante Clp, et son accumulation dans le mutant clpP conduit à l'inhibition de l'activité de sigma D, et donc à une perte de la motilité, la chimiotaxie et la séparation des cellules.

Légendes des photos :

Figure 1: Immunolocalisation par microscopie électronique de la piline Gbs1477 à la surface de la souche S. agalactiae NEM316. Les bactéries étaient analysées avec un antisérum de lapin anti-Gbs1477 et des particules (10-nm) d'or conjugués avec des IgG anti-lapin de souris. Les échantillons étaient visualisés par microscopie à balayage (Plate-forme de microscopie électronique, IP).

Figure 2 : Phénotype du mutant ÆclpP de B. subtilis sous microscopie à fluorescence montrant un défaut de séparation cellulaire: les membranes sont colorées en rose et les acides nucléiques en bleu.

Mots-clés: Bactéries Gram-positives, expression génétique, facteurs de virulence, réponses au stress, transduction de signal



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  DUGAST Christine (cdugast@pasteur.fr) DEBARBOUILLE Michel DR2 CNRS mdebarbo@pasteur.fr

DRAMSI Shaynoor Chargé de Recherche IP sdramsi@pasteur.fr

MSADEK Tarek Chef de Laboratoire IP tmsadek@pasteur.fr

POYART Claire Professeur Hôpital Cochin cpoyart@pasteur.fr

DUBRAC Sarah Chercheur Post-doctoral sdubrac@pasteur.fr

FORQUIN Marie-Pierre Etudiante Master mforquin@pasteur.fr

GAILLOT Olivier MCU-PH ogaillot@pasteur.fr (parti le 01/12/05)

GUERIRI Ibtissem Etudiante en thèse igueriri@pasteur.fr

MISTOU Michel-Yves CR1 INRA mistou@pasteur.fr

CALIOT Marie-Elise Ingénieur de Recherche IP ecaliot@pasteur.fr

POUPEL Olivier Technicien Supérieur IP opoupel@pasteur.fr


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