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     Apoptose et système immunitaire - CNRS URA 1961


  Responsable : SUSIN, Santos A. (susin@pasteur.fr)


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La mort cellulaire programmée (MCP) ou apoptose fait partie intégrante de la physiologie normale d'un organisme. Une dérégulation de la MCP peut-être à l'origine de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives et auto-immunes). Dans de nombreux modèles, ce processus hautement contrôlé est lié à l'activation d'une famille de protéases à cystéine, les caspases. Néanmoins, de nombreuses données se sont accumulées en faveur de l'existence de voies de mort alternatives indépendantes des caspases. L'équipe Apoptose et Système Immunitaire se consacre à l'étude de ces nouveaux mécanismes de mort cellulaire dans le contexte du système immunitaire. Notre projet de recherche vise deux objectifs majeurs: 1) Définir les mécanismes biochimiques qui régulent la mort cellulaire médiée par CD47 dans la leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B); 2) Identifier les mécanismes moléculaires de l'un des agents essentiels de l'apoptose caspase-indépendante, la protéine mitochondriale AIF



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I. Identification des mécanismes qui régulent la mort cellulaire médiée par CD47 dans la leucémie lymphoïde chronique B (Marlène Bras, Nadine Robert & Clémence Virely).

L'engagement de l'antigène CD47 (IAP) par son ligand physiologique, la thrombospondine, ou par un anticorps agoniste anti-CD47 mimant les effets du ligand, induit une forme de mort cellulaire indépendante des caspases. À travers une analyse cellulaire multi-paramétrique, nous avons montré que la mort des cellules B de LLC-B induite par la stimulation du récepteur CD47 présente de nombreuses caractéristiques biochimiques typiques de l'apoptose: chute du potentiel membranaire mitochondrial (DYm), production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), exposition des résidus de phosphatidylsérine dans le feuillet externe de la membrane plasmique et perméabilisation des lysosomes. Une analyse de l'ultrastructure cellulaire par microscopie électronique a également montré que ces altérations cytosoliques sont accompagnées d'un gonflement du réticulum endoplasmique et de l'appareil de Golgi ainsi que d'un changement de la morphologie des crêtes mitochondriales. L'ensemble de ces données nous permet donc d'identifier la mort cytosolique médiée par CD47 comme une mort cellulaire de type "necrosis-like". La fonctionnalité de cette voie de mort est conservée dans les cellules de LLC-B alors que celles-ci se montrent fréquemment résistantes à d'autres types d'apoptose.

La MCP médiée par CD47 semble indépendante des principaux membres de la famille de Bcl-2. En effet, après induction de la mort par l'engagement de l'anticorps anti-CD47, nous n'observons pas les formes conformationnellement actives des protéines Bax, Bak, ni la re-localisation mitochondriale de la protéine "BH3-only" Bim. De plus, alors que la surexpression des membres anti-apoptotiques de cette famille (Bcl-XL, Bcl-2 et Mcl-1) protège efficacement les cellules leucémiques de la mort induite par des agents affectant la mitochondrie tel que l'étoposide (inhibiteur de la topoisomérase II) aucun effet protecteur n'a été mis en évidence dans la mort médiée par CD47. De même, l'extinction protéique des principaux membres anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 (Bax, Bak et Bim) par la technique de siRNA ne module pas la mort induite par l'engagement de CD47. En aval de la mitochondrie, nous n'observons pas de relargage des protéines pro-apoptotiques mitochondriales AIF, cytochrome c, EndoG, Omi/HtrA2 ou Smac/Diablo. Par comparaison, le traitement des lymphocytes B de patients atteints de LLC-B par l'hydrocortisone, un glucocorticoïde auquel ces cellules sont restées sensibles, induit une mort cellulaire caractérisée par une altération du DYm, un relarguage des protéines pro-apoptotiques mitochondriales cytochrome c et AIF ainsi qu'une activation de la caspase 3. Ces évènements, dépendants de l'activité de cette protéase, ne sont plus observés dès lors que l'on utilise un inhibiteur spécifique de la caspase 3, le z-DEVD.fmk. En revanche, la mort induite par CD47 n'est inhibée ni par des inhibiteurs généraux des caspases ni par des inhibiteurs spécifiques des caspases 2, 3, 6, 7, 8, 9 et 10.

D'autre part, les altérations ultrastruturales observées dans les cellules avec l'anticorps anti-CD47 suggèrent une complète désorganisation du cytosquelette. Une étude, réalisée par immunofluorescence, de ses différents constituants (microfilaments d'actine, microtubules et filaments intermédiaires) nous a permis de mettre en évidence une désorganisation spécifique du réseau de microfilaments d'actine.

Nous étudions actuellement les effecteurs qui pourraient être impliqués dans la survenue des altérations mitochondriales et la désorganisation du cytosquelette observées lors de l'engagement de CD47. En parallèle, nous cherchons à identifier les protéines impliquées dans la transduction du signal de mort initié lors de la stimulation de CD47.

II. Approfondissement des connaissances de la régulation cellulaire de la la protéine mitochondriale AIF (Jeanne Lesbordes-Brion, Sophie Laine, Rana Moubarak & Victor J. Yuste-Mateos)

AIF est une protéine mitochondriale possédant à la fois une fonction oxydo-réductase et une fonction apoptotique. Bien que ces fonctions aient été déjà caractérisées, de nombreuses questions relatives au mode d'action de la protéine restent encore sans réponse. L'objectif de notre projet est ainsi de définir les mécanismes moléculaires qui déterminent les fonctions de AIF et d'approfondir les connaissances du mécanisme de régulation cellulaire de la mort caspase-indépendante "apoptosis-like" et du rôle de AIF dans cette régulation.

-Caractérisation des isoformes de AIF: Il existe deux isoformes de AIF issues respectivement de l'épissage alternatif de l'exon 2 (variant 1) et de l'exon 2b (variant 2). Par une approche de RT-PCR nous avons identifié deux nouvelles formes de AIF dû à l'epissage alternatif d'un nouvel exon découvert dans un intron. Afin de mieux comprendre le rôle de ces nouveaux variants dans le processus d'apoptose, nous avons caractérisé d'une part leur distribution tissulaire chez l'homme ainsi que leur localisation cellulaire et d'autre part leurs fonctions dans la mort cellulaire programmée. L'un de ces variants résulte de l'apparition d'un nouveau site de départ de la traduction entraînant la perte de la partie N-terminale de la protéine. Cette nouvelle forme de AIF qui ne possède pas la région oxydoréductase de la protéine entraîne une mort indépendante des caspases et induit une fragmentation de l'ADN en fragments de 50Kb. Nous cherchons à approfondir actuellement la fonction de ces nouveaux variants au sein de la cellule ainsi que leur rôle dans la mort cellulaire indépendante des caspases.

-Identification des facteurs qui interagissent avec AIF avant et après un stimulus apoptotique: À partir d'une construction AIF-FLAG et à l'aide d'expériences d'immunoprécipitation, nous avons obtenu, en collaboration avec la plate-forme de protéomique de l'Institut Pasteur, les séquences de plusieurs protéines potentiellement partenaires de AIF. Des études de liaisons entre ces protéines et AIF sont actuellement effectuées afin de démontrer leurs interactions potentielles.

De plus, au cours de cette année, notre groupe a pu déterminer le domaine minimal de AIF responsable de l'induction de l'apoptose. Dans ce contexte, nous avons entrepris une approche de double-hybride chez la levure afin d'identifier des molécules intervenant dans la voie de mort cellulaire indépendante des caspases.

Les données ainsi obtenues seront complétées par des expériences fonctionnelles qui nous permettrons de sélectionner des cofacteurs d'AIF.

-Description de la voie de mort impliquant AIF: En premier lieu, nous avons déterminé l'implication des caspases effectrices ainsi que Bid et d'autres protéines à domaine "BH-3-only" dans le relargage de AIF de la mitochondrie. Ainsi, nous avons démontré qu'un large spectre de drogues pro-apoptotiques induisait le relargage de AIF de la mitochondrie de fibroblastes embryonnaires murins (MEFs) déficients en caspase-3 et -9. La sortie de AIF de la mitochondrie au cytosol est donc effectivement un processus caspase-indépendant. Par ailleurs, nous étudions l'implication de Bid dans le relargage de AIF dans le cadre d'un projet Pasteur-Weizmann établi avec l'équipe du Dr Atan Gross au Weizmann Institute. Nous étudions actuellement le rôle de Bax et Bak dans la voie de mort impliquant AIF au moyen de cellules MEF déficientes en Bax et/ou Bak. De plus, afin d'élucider les conséquences biochimiques de la surexpression d'AIF, des lignées cellulaires stables exprimant AIF sous le contrôle d'un promoteur inductible ont été générées. Ainsi, nous établirons l'effet de la surexpression d'AIF sur les fonctions cellulaires (glucolyse oxydative/non-oxydative, fonction de la chaine respiratoire, cycle cellulaire et prolifération), ainsi que sur la susceptibilité des cellules à entrer en apoptose.

-Élimination de AIF par la technique de RNAi, effets sur l'apoptose: La technique de RNAi (RNA interférence) permet de diminuer l'expression d'une protéine au moyen de l'introduction dans la cellule d'un petit ARN de double chaîne, spécifique de l'ARN messager à détruire. Nous avons dessiné des siRNA (short interference RNA) de 19 nucléotides qui correspondent à la région 5' de l'ARN messager de AIF. Après la transfection de ces oligonucléotides dans des cellules HeLa, nous avons pu observer par Western blot et par immunofluorescence une diminution de 80% de l'expression de AIF. Après la confirmation de ces résultats par RT-PCR, nous travaillons actuellement sur les voies de signalisation de l'apoptose qui pourraient être affectées par la diminution du niveau d'expression de AIF.

-Activité anti-tumorale de AIF: Dans le but d'approfondir l'implication de AIF dans les cancers, nous étudions également l'expression de la protéine dans différentes lignées cellulaires tumorales traitées avec des inducteurs de stress oxydatif, des agents chimiothérapeutiques ou par irradiation. Nous cherchons actuellement à démontrer le lien de cause à effet entre déficit d'AIF et oncogénèse.

Les résultats obtenus fourniront les données nécessaires pour connaître les partenaires de AIF et permettront aussi d'évaluer l'implication de AIF dans le développement des tumeurs et de déterminer s'il peut être un marqueur diagnostique et pronostique des cancers.

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  AYTAC, Marie-Dominique, (mdaytac@pasteur.fr) SUSIN, Santos A., CR1 CNRS (susin@pasteur.fr) LESBORDES-BRION, Jeanne, Stagiaire post-doctorale (jbrion@pasteur.fr)

YUSTE-MATEOS, Victor J., Stagiaire post-doctoral (vyuste@pasteur.fr)

BRAS, Marlène, Doctorante (mbras@pasteur.fr)

MOUBARAK, Rana, Doctorante (moubarak@pasteur.fr)

VIRELY, Clémence, Stagiaire Master 2 (cvirely@pasteur.fr)

ROBERT, Nadine TS Pasteur (nadou@pasteur.fr)

LAINE, Sophie TS-CDD (laine@pasteur.fr)


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