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     Allergologie moléculaire et cellulaire


  Responsable : Daëron, Marc (daeron@pasteur.fr)


  resume

 

Le travail de l'Unité d'Allergologie Moléculaire et Cellulaire a pour objectifs 1) d'analyser les mécanismes moléculaires qui régulent, positivement et négativement, l'activation des cellules effectrices de l'allergie, 2) de déterminer les rôles des différents RFc humains et des cellules qui les expriment dans des modèles murins de maladies allergiques et inflammatoires chez des souris dont les RFc auront été remplacés par les RFc humains correspondants et 3) de rechercher des anomalies de régulation chez des patients allergiques.



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L'activation des cellules hématopoïétiques est contrôlée par des récepteurs membranaires qui délivrent des signaux positifs et des signaux négatifs. Ces signaux sont intégrés dans des complexes de signalisation qui s'organisent autour d'adaptateurs transmembranaires. En conséquence, les réponses immunitaires normales sont étroitement contrôlées. Nous avions démontré que les RFcγIIB, des récepteurs pour la portion Fc (RFc) des IgG, peuvent inhiber l'activation cellulaire induite par les immunorécepteurs comme les récepteurs pour les IgE (RFcεI) exprimés par les mastocytes et les basophiles. Cette propriété dépend d'un Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif (ITIM) que nous avons identifié dans le domaine intracytoplasmique des RFcγIIB murins et humains et qui a été, par la suite, retrouvé dans un grand nombre d'autres récepteurs inhibiteurs. Lorsque les RFcγIIB sont co-agrégés avec des récepteurs activateurs sur la même cellule par des complexes immuns, leur ITIM est phosphorylé et recrute la phosphatidylinositol 5-phosphatase SHIP1 qui est responsable des effets inhibiteurs. Ces résultats ont été validés in vivo chez des souris RFcγIIB-/- et chez des souris SHIP1-/-.

Le projet de recherche de l'unité repose sur l'hypothèse que les allergies puissent résulter de défaut(s) des régulations négatives qui préviennent la survenue des manifestations allergiques chez les individus normaux et/ou de leur intégration. Il a pour objectif d'évaluer la contribution de tels défauts dans les allergies et de les caractériser afin de développer des moyens de les corriger ou d'utiliser la régulation négative comme une nouvelle approche thérapeutique. Notre travail porte particulièrement sur la régulation, par les RFcγIIB, de l'activation des cellules effectrices de l'allergie par les RFc activateurs. Ce projet comprend trois approches menées simultanément : une analyse in vitro des interactions moléculaires régulant l'activation cellulaire, une étude in vivo des interactions entre les RFc humains dans des modèles d'allergies chez des souris dont les RFc endogènes auront été " humanisés ", et une exploration ex vivo de la régulation négative de l'activation cellulaire chez des patients allergiques. Les principaux résultats obtenus en 2005 sont les suivants.

Les RFcγIIB humains recrutent également SHIP1, mais par un autre mécanisme

Dans un travail précédent, nous avions montré que le recrutement de SHIP1 sur l'ITIM des RFcγIIB murins nécessite sa stabilisation par l'adaptateur cytosolique Grb2, lui même recruté sur un second motif à tyrosine (Isnardi et al. J. Biol. Chem. 2004). Ce motif manque dans les RFcγIIB humains. Nous avons montré que ceux-ci recrutent néanmoins SHIP1, dont le recrutement sur l'ITIM est stabilisé par un autre mécanisme dépendant de séquences C-terminales du récepteur humain (Isnardi et al. Immunol. Letters, in press).

Le cytosquelette d'actine, un compartiment inhibiteur des signaux d'activation dans les mastocytes

Nous avons montré que, dans les mastocytes, le recrutement de SHIP1 par les RFcγIIB murins a lieu dans le cytosquelette d'actine qui fonctionne comme un compartiment inhibiteur. Lorsque les RFcεI sont agrégés ou lorsqu'ils sont coagrégés avec les RFcγIIB, les agrégats de RFc s'associent au cytosquelette où l'isoforme de haut poids moléculaire de SHIP1 est constitutivement associée à la filamine. Celle-ci libère SHIP1 qui reste lié à l'ITIM phosphorylé des RFcγIIB. Ainsi, les RFcγIIB concentrent la phosphatase inhibitrice à proximité de son substrat, dans le complexe de signalisation engendré par les RFcεI avec lesquels ils sont co-agrégés (Lesourne et al., J. Immunol. 2005).

Intégration des signaux positifs et négatifs par les adaptateurs transmembranaires LAT et NTAL

Les adaptateurs transmembranaires LAT et NTAL sont co-exprimés dans les mastocytes. Leur domaine intracytoplasmique contient de nombreuses tyrosines qui, lorsqu'elles sont phosphorylées, contribuent à organiser le complexe de signalisation qui se constitue sous les RFcεI agrégés. En collaboration avec Marie et Bernard Malissen, nous avions montré que les effets dominants positifs de LAT sont en fait la somme de signaux positifs et de signaux négatifs qui dépendent de tyrosines distinctes (Malbec et al., J. Immunol., 2004). Nous avons également observé qu'NTAL exerce un effet dominant négatif dans les mastocytes. A l'aide de souris déficientes pour l'une, l'autre ou les deux adaptateurs, nous analysons les interactions entre ces deux molécules afin de déterminer comment elles engendrent des signaux négatifs et des signaux positifs et comment ces signaux modulent les réactions allergiques.

Un nouveau modèle de mastocytes primaires chez la souris

Les Bone Marrow-derived Mast Cells (BMMC) sont le seul modèle disponible de mastocytes murins primaires en culture. Ces cellules immatures ont l'inconvénient de ne pas avoir d'équivalent physiologique in vivo. Nous avons établi les conditions permettant l'expansion in vitro de mastocytes différencies. Nous obtenons en quelques semaines une population homogène de mastocytes matures de type séreux, très semblables aux mastocytes péritonéaux. Les réponses biologiques et les voies de transduction mises en œuvre par les RFc dans ces cellules et dans les BMMC ne sont pas identiques.

Un nouveau récepteur pour les IgG chez la souris

Nous avons identifié un nouveau RFc, le RFcγIV, dont le gène est situé entre les gènes codant le RFcγIIB et le RFcγIII sur le chromosome 1 de la souris. Ce récepteur possède deux domaines extracellulaires glycosylés, un domaine transmembranaire et un domaine intracellulaire dépourvu de motif d'activation ou d'inhibition. Il n'existe que chez la souris, mais il est très semblable au RFcγIIIA humain. Pour être exprimé à la membrane le RFcγIV doit s'associer à la sous-unité commune FcRγ qui contient des motifs d'activation et, lorsqu'il est agrégé par des complexes immuns, il induit des signaux d'activation. Il est exprimé par les monocytes/macrophages et les neutrophiles. Par immunofluorescence sur des cellules transfectées d'une part, et par résonance plasmonique de surface sur Biacore (en collaboration avec P. England) d'autre part, nous avons montré que le RFcγIV fixe avec une affinité intermédiaire, les IgG2a et les IgG2b de souris, mais pas les IgG1 ou les IgG3. Nous avons démontré un rôle in vivo du RFcγIV dans un modèle de thrombopénie autoimmune. L'injection à des souris normale d'anticorps anti-plaquettes induit une chute de 85% des plaquettes. Nous avons observé que l'injection d'anticorps anti-RFcγIV bloquants avant l'injection des anticorps anti-plaquettes réduit la thrombopénie de 60%, alors que la délétion de l'un ou l'autre des deux autres RFcγ activateurs (RFcγI ou RFcγIII) n'a pas d'effet (Bruhns et al., Immunity, 2005).

Rôles in vivo des RFc humains dans des modèles murins d'allergie chez des souris " humanisées ".

Nos connaissances sur la physiologie des RFc ont progressé grâce à l'étude de souris KO pour ces récepteurs. Des différences notables empêchent de transposer chez l'homme les résultats obtenus chez la souris. Nous avons donc entrepris de construire des souris dont les RFc auront été remplacés par des RFc humains. Afin d'exprimer des RFc humains chez la souris, nous utilisons des Chromosomes Bactériens Artificiels (BAC) contenant des fragments de chromosomes humains où sont localisés des gènes codant les RFc humains, comme le RFcγIIA, par exemple. Une fois le gène du RFcγIIA isolé du reste du BAC, il est ensuite injecté dans un pronucleus de souris C57BL/6, en collaboration avec la Plateforme de Transgénèse de l'Institut dirigée par F. Langa-Vives. Les souris RFcγIIATg ainsi obtenues seront croisées avec des souris triplement déficientes pour les RFcγI/II/III murins (produites par S. Verbeek aux Pays-Bas) afin d'étudier le rôle du RFcγIIA en absence des autres RFcγ endogènes. Cette stratégie sera appliquée aux autres RFcγ et RFcε humains afin d'obtenir une souris dans lequel tous les RFc pour les IgG et pour les IgE auront été " humanisés ". En injectant des anticorps humains à ces souris, nous rechercherons les rôles respectifs de ces récepteurs et des cellules qui les expriment dans des modèles expérimentaux de maladies inflammatoires et allergiques.

RFc exprimés par les basophiles humains

Les RFc exprimés par cellules effectrices de l'allergie sont mal connus. Nous avons donc entrepris d'identifier ces récepteurs et, notamment, de déterminer l'expression relative des RFc activateurs et des RFc inhibiteurs sur des basophiles circulants, chez des donneurs normaux et, en collaboration avec M.-T. Guinnepain et J. Laurent, au Centre Médical de l'Institut, chez des patients atteints de diverses affections allergiques.

Mots-clés: Allergies, immunorégulation, anticorps, récepteurs de Fc, adaptateurs transmembranaires, signalisation intracellulaire



  publications

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  personnel

  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  Papelard, Solange, (papelard@pasteur.fr) Daëron, Marc, DR1 INSERM, (daeron@pasteur.fr)

Bruhns, Pierre, CR2 INSERM, (bruhns@pasteur.fr)
Schiffer, Cécile, Post-doc (cecile.schiffer@pasteur.fr)

Meknache, Nihad, Post-doc , (meknache@pasteur.fr)

Roget, Karine, PhD student, Univ. Paris 6, (kroget@pasteur.fr)

Mancardi, David, PhD student, Univ. Paris 6, (mancardi@pasteur.fr)

Schreiber, Joseph, Etudiant, Univ. Wisconsin, ( jjschreiber@students.wisc.edu)
Malbec, Odile, Engineer (IE2 INSERM), (omalbec@pasteur.fr)

Iannascoli, Bruno, Qualified Technician Pasteur, (biannasc@pasteur.fr)


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