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     Agents Antibactériens


  Responsable : COURVALIN Patrice (pcourval@pasteur.fr)


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L'Unité des Agents Antibactériens étudie le support génétique, les mécanismes biochimiques, l'expression hétérospécifique, l'évolution et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes pour l'homme, notamment dans les systèmes suivants : entérocoques et glycopeptides, la résistance aux aminosides chez les bacilles à Gram négatif, ainsi que le transfert de gènes des bactéries aux cellules de mammifères.



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Résistance aux glycopeptides de type VanB chez Enterococcus (F. Depardieu en collaboration avec A. Kolb, Unité des Régulations transcriptionnelles, Institut Pasteur)

La résistance aux glycopeptides chez les entérocoques résulte de la production de précurseurs du peptidoglycane terminés par D-alanyl-D-lactate (D-Ala-D-Lac) (VanA, VanB et VanD) ou D-Ala-D-sérine (VanC, VanE et VanG) pour lesquels les glycopeptides présentent une faible affinité et de l'élimination de ceux terminés par D-Ala-D-Ala synthétisés par la ligase Ddl de l'hôte.

Nous avons étudié l'isolat clinique E. faecium BM4524 hautement résistant à la vancomycine qui héberge un groupe de gènes vanB chromosomique comprenant les gènes vanRB et vanSB d'un système régulateur à deux composantes et les gènes de résistance vanYBWHBBXB qui sont respectivement co-transcrits de manière inductible à partir des promoteurs de régulation PRB et de résistance PYB. Nous avions montré précédemment que le capteur VanSB s'autophosphoryle et transfère son phosphate au régulateur VanRB. Dans cette étude, la régulation transcriptionelle des gènes de régulation et de résistance a été analysée et les sites de fixation de VanRB et VanRB phosphorylée aux régions promotrices PRB et PYB ont été comparés. VanRB purifiée a été phosphorylée en présence d'acétylphosphate (VanRB-P). VanRB-P se fixe à un seul site centré à -32.5 en amont du site d'initiation de la transcription du promoteur PRB et à deux sites centrés à -33.5 et -55.5 en amont du promoteur PYB. VanRB-P se dimérise après traitement à l'acétylphosphate et ainsi se fixe avec une plus grande affinité que VanRB sur ces cibles permettant une transcription accrue. VanRB-P recrute l'ARN polymérase et apparaît plus efficace que VanRB dans la formation du complexe ouvert au niveau des promoteurs PRB et PYB. Les promoteurs PRB et PYB sont régulés de façon coordonnée mais différemment. En effet, le promoteur PRB est capable de recruter l'ARN polymérase en l'absence de VanRB et VanRB-P conduisant ainsi, en l'absence d'induction, à la transcription des gènes régulateurs à bas niveau ce qui permet ensuite en présence de vancomycine, de déclencher la boucle d'autorégulation positive pour l'expression des gènes de résistance.

Effet de la novobiocine sur l'expression de la résistance à la vancomycine de type VanE chez E. faecalis BM4405 (L. Abadía-Patiño et B. Périchon en collaboration avec M. Chippaux, CNRS, Marseille)

La souche de E. faecalis BM4405 de type VanE est résistante à la vancomycine. Des dérivés sensibles à cet antibiotique ont été obtenus, avec une fréquence élevée, après traitement de la souche par la novobiocine, un inhibiteur de la sous-unité b de l'ADN gyrase. La détermination de la séquence de l'opéron vanE d'un dérivé sensible, BM4405-1, a permis de mettre en évidence deux mutations aboutissant à une substitution dans la ligase D-Ala-D-Ser VanE et dans le régulateur transcriptionnel VanRE. Cependant, l'opéron vanE de BM4405-1 cloné dans une souche de E. faecalis sensible aux glycopeptides confère la résistance à la vancomycine, ce qui indique que ces mutations ne sont pas responsables de la sensibilité à l'antibiotique. La détermination de la séquence du gène gyrB de BM4405-1 a montré la présence d'une mutation responsable de la substitution dans GyrB d'un résidu, K337Y, requis pour l'activité ATPase et donc impliqué dans le sur-enroulement de l'ADN. L'introduction du gène gyrB de BM4405 dans BM4405-1 restaure la résistance à la vancomycine. L'altération du sur-enroulement de l'ADN pourrait être responsable de la perte d'expression de l'opéron vanE et donc de la sensibilité à la vancomycine chez BM4405-1.

Caractérisation des opérons van responsable de la résistance aux glycopeptides chez Paenibacillus (L. Guardabassi et B. Périchon en collaboration avec J. van Heijenoort et D. Blanot, Université Paris-Sud, Orsay)

L'organisation et la séquence des opérons van de deux souches de Paenibacillus isolées du sol et résistantes aux glycopeptides ont été caractérisées. Des gènes de régulation et de résistance, homologues à ceux des opérons vanA et vanB des entérocoques, ont été trouvés. La résistance au glycopeptide chez ces souches est inductible par la vancomycine et la teicoplanine et est due à la synthèse de précurseurs du peptidoglycane contenant de l'acide diamino-pimélique qui se terminent par D-Ala-D-Lac. La forte similitude de ces opérons avec ceux des entérocoques permet d'émettre l'hypothèse que la résistance acquise aux glycopeptides chez les entérocoques provient des bactéries du sol.

Dissémination clonale d'isolats pédiatriques de Streptococcus pyogenes type emm 6 résistants à la ciprofloxacine. (M. Galimand en collaboration avec R. Alonso, Facultad de Farmacia, Vitoria-Gasteiz, Espagne)

Vingt-quatre souches communautaires de S. pyogenes résistantes à la ciprofloxacine et sensible aux autres quinolones ont été étudiées. La détermination de la séquence des régions déterminant la résistance aux quinolones des gènes gyrA et parC a révélé une mutation T/G dans le gène parC conduisant à la substitution Ser79Ala dans ParC. Tous les isolats appartiennent au type emm 6. L'analyse par électrophorèse en champ pulsé a révèlé que dix-huit d'entre eux étaient indiscernables et que deux étaient très proches. Les fluoroquinolones peuvent sélectionner des mutants résistants chez des espèces bactériennes qui n'en sont pas la cible et ne sont pas utilisées chez l'enfant. Ainsi, l'émergence de souches de S. pyogenes résistantes à la ciprofloxacine, et plus particulièrement d'isolats pédiatriques, est préoccupante et souligne la nécessité d'une utilisation judicieuse des antibiotiques.

Le gène armA disséminé mondialement est porté par le transposon composite Tn1548. (M. Galimand, S. Sabtcheva et T. Lambert)

Le gène armA (aminosides résistance méthylation) qui confère la résistance de haut niveau aux désoxystreptamines bi-substituées en 4,6 et à la fortimicine par modification post-transcriptionnelle de l'ARNr 16S a été initialement trouvé chez la souche de Klebsiella pneumoniae BM4536 sur un plasmide du groupe d'incompatibilité IncL/M d'environ 90 kb. Ce plasmide, pIP1204, code aussi pour une ß-lactamase à spectre étendu CTX-M-3. Le gène armA a été détecté dans des isolats cliniques de souches de Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, K. pneumoniae, Salmonella enterica et Shigella flexneri de divers pays où il est toujours associé à blaCTX-M-3 sur un plasmide IncL/M. Le gène armA fait partie du transposon composite Tn1548 avec les gènes ant3''9, sul1 et dfrXII qui confèrent respectivement la résistance à la streptomycine-spectinomycine, aux sulfamides et au triméthoprime. Cet élément génétique de 16,6 kb est flanqué de deux copies de IS6 et dissémine par transposition réplicative. Cette observation rend compte de la présence de armA sur des plasmides auto-transférables de différents groupes d'incompatibilité et de sa répartition mondiale.

In vitro sélection de mutants de Streptococcus pneumoniae résistants aux macrolides et au linézolide ; relation avec leur sensibilité à la pénicilline G ou aux macrolides. (M. Galimand en collaboration avec l'Hôpital Archet, Nice, France)

La rapidité d'acquisition de la résistance aux macrolides par S. pneumoniae ne diffère pas pour les macrolides à 14 ou à 16 chaînons utilisés lors de la sélection. La résistance au linézolide chez les souches sensibles à la pénicilline G et à l'érythromycine est plus difficile à obtenir que celle aux macrolides. Tous les mutants résistants au linézolide (30) présentent une mutation dans 2 à 4 copies du gène rrl codant pour l'ARNr 23S, principalement la mutation G2576U (27/30), certains mutants possédant une seconde mutation C2610U. Deux nouvelles mutations ont été observées, C2612A et C2571G. Chez trois mutants résistants au linézolide aucune mutation n'a été identifiée dans le domaine étudié suggérant un autre mécanisme de résistance. L'augmentation de la résistance à ces antibiotiques doit par conséquent influer sur l'utilisation du linézolide en clinique.

Transfert bactérien de genes dans des cellules humaines (C. Grillot-Couvalin et S. Goussard en collaboration avec I. Fajac (Hôpital Cochin), I. Castagluiolo (Padoue, Italie) et D. Schindelhauer (Munich, Allemagne)

Elargissant leur spectre d'hôte, nous avons montré que les vecteurs bactériens sont capables de transférer des gènes dans des épithélia différenciés de type pulmonaire normaux ou dans des lignées établies à partir de patients atteint de mucoviscidose. Ces vecteurs permettent également de propager de façon stable et de transférer des mini-chromosomes artificiels et notamment une construction de 160 kb contenant une grande portion du gène CFTR. Enfin, pour permettre l'étude de ces vecteurs dans des stratégies vaccinales, un modèle murin de colonisation nasal par S. aureus a permis l'étude des facteurs impliqués dans la colonisation .

Centre National de Référence de la Résistance aux Antibiotiques

Evaluation de techniques non automatisées pour la détection phénotypique de Staphylococcus aureus de type VanA (C. Girard-Blanc)

Du fait de leur importance majeure en santé publique, nous avons évalué la capacité de diverses techniques non automatisées de détermination in vitro de la sensibilité aux antibiotiques à détecter la résistance aux glycopeptides chez trois souches de S. aureus résistantes à la méticilline et de type VanA. Les concentrations minimales inhibitrices ont été déterminées selon les recommandations du US National Committee for Clinical Laboratory Standards, du Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie et de la British Society for Antimicrobial Chemotherapy à l'aide du E-test, de la diffusion en agar, du criblage en agar et de galleries ATB STA¨H. Dans chacune de ces méthodes, la vancomycine était plus efficace que la teicoplanine pour détecter la resistance aux glycopeptides.

Groupe d'étude Antibio-Résistance (GEAR). Nous avons procédé au contrôle de qualité externe d'une étude multicentrique de surveillance de la résistance effectuée dans le réseau international des Instituts Pasteur.

Nous avons déterminé le génotype de résistance, notamment aux glycopeptides chez les cocci à Gram positif et aux α -lactamines chez les bacilles à Gram négatif, des isolats cliniques adressés au Centre.

Mots-clés: Bactériologie, antibiotiques, résistance, transfert de gènes



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  Secrétariat Chercheurs Stagiaires Autre personnel
  MURGUET Sylvie, smurguet@pasteur.fr

SITBON Pascale, pvanstee@pasteur.fr

BOZDOGAN Bülent, IP, M.D., Docteur ès-Sciences, Directeur adjoint du C.N.R.

CHESNEAU Olivier, IP, Chargé de Recherche, Docteur ès-Sciences, chesneau@pasteur.fr

GALIMAND Marc, IP, Chargé de Recherche, Docteur ès-Sciences, galimand@pasteur.fr

GRILLOT-COURVALIN Catherine, Directeur de recherche CNRS, M.D., Docteur ès-Sciences, ccourval@pasteur.fr

LAMBERT Thierry, Professeur Université, Docteur en Pharmacie, Docteur ès-Sciences, tlambert@pasteur.fr

AGRESTI Angela, Etudiante ès-Sciences, co-tutelle

BERTHET Nicolas, Etudiant ès-Sciences, nberthet@pasteur.fr

CANE David, M.D., Professeur invité

CANOVA Marc, Etudiant ès-Sciences

COYNE Sébastien, Intern. Pharm., Etudiant ès-Sciences, sebcoyne@pasteur.fr

DORSY Vincent, Etudiant ès-Sciences

FOUCAULT Marie-Laure, Etudiante ès-Sciences, foucault@pasteur.fr

GONZÁLEZ-ZORN Bruno, Docteur Vétérinaire, Ph.D., Post-Doc, bgzorn@pasteur.fr

GUARDABASSI Luca, Docteur Vétérinaire, Ph.D., Post-Doc,

GUESSENND KOUADIO Aya-Nathalie, Etudiante ès-Sciences, co-tutelle

LIOU Grace, Ph.D., Post-Doc, gliou@pasteur.fr

DAMIER-PIOLLE Laurence, Ingénieur, IP, Docteur ès-Sciences, ldamier@pasteur.fr

DEPARDIEU Florence, Technicienne Supérieure, IP, Etudiantes ès-Sciences, fdepard@pasteur.fr

GIRARD-BLANC Christine, Technicienne Supérieure, IP, girardbc@pasteur.fr

GOUSSARD Sylvie, Technicienne Supérieure, IP, sgouss@pasteur.fr

PERICHON Bruno, Ingénieur, IP, Docteur ès-Sciences, brunoper@pasteur.fr


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