Unité: Pathogénie Bactérienne des Muqueuses

Responsable: LABIGNE Agnès

Les travaux de l'Unité portent sur l'étude du pouvoir pathogène de bactéries colonisant les muqueuses : Helicobacter pylori qui est une bactérie impliquée dans la genèse des pathologies gastro-duodénales inflammatoires (gastrites chroniques, ulcères peptiques, cancers gastriques et lymphome de MALT) et les Escherichia coli pathogènes qui sont associés à des diarrhées et des infections extra-intestinales (infections urinaires, méningites, septicémies). Génomique fonctionnelle et comparative, études des interactions des bactéries avec les cellules épithéliales et les cellules immunitaires, ainsi que des voies de signalisation qu'elles induisent, analyse des réponses immunitaires associées aux infections, caractérisation des lésions génotoxiques associées au processus inflammatoire, identification de nouvelles cibles thérapeutiques, études épidémiologiques figurent parmi les approches mises en œuvres pour l'étude de ces pathogènes des muqueuses.

BACTERIES DU GENRE HELICOBACTER

La prévalence des infections à H. pylori est extrêmement importante puisqu'elle atteint 30 % de la population dans les pays industrialisés et 80 à 95 % dans les pays en voie de développement. C'est très probablement l'infection bactérienne la plus répandue à la surface du globe et les pathologies sévères qu'elle induit constituent un enjeu économique de première importance : rappelons que 10 % de la population dans nos pays souffrent d'ulcères peptiques, et que l'on estime, sur la base de données récentes, que 1 % des personnes infectées par H. pylori développeront une néoplasie gastrique (adénocarcinome ou lymphome).

Différents projets sont à l'heure actuelle poursuivis. Parmi ceux-ci citons : les études concernant le métabolisme de l'azote, du nickel et du peptidoglycane ; la mise en œuvre d'approches de génomique comparative, sur un large échantillon de souches cliniques, et de génomique fonctionnelle ; l'analyse du rôle des réponses inflammatoires dans la genèse des dommages induits au cours des infections chroniques ; la caractérisation des enzymes impliquées dans la réparation de l'ADN chez H. pylori. Seront plus largement décrites ci-dessous les études ayant fait l'objet de travaux publiés en 2004.

La réponse adaptative de H. pylori à l'environnement gastrique (Stéphanie Bury-Moné, Marie Thibonnier, Kerstin Stingl, et Hilde De Reuse)

Il existe, chez les bactéries pathogènes, un lien entre la virulence et la capacité à survivre au stress rencontré lors de la colonisation de l'hôte. H. pylori présente la particularité exceptionnelle d'être capable de résister à l'acidité extrême rencontrée lors de son passage dans la lumière gastrique, et de s'adapter à l'acidité modérée qu'elle rencontre au niveau du mucus stomacal où elle se multiplie. La génomique fonctionnelle a été utilisée pour explorer la réponse de H. pylori à l'acidité modérée. Nous avons comparé le transcriptome de H. pylori (souche 26695) ayant poussé à pH neutre à celui obtenu après croissance à pH5. Il est apparu que l'acidité est un signal modulant l'expression de différents facteurs de virulence. L'expression des gènes codant pour l'uréase et pour deux amidases aliphatiques est induite à bas pH. Nos résultats indiquent que l'adaptation à l'acidité modérée est, chez H. pylori, fortement liée à sa capacité à produire de grandes quantités d'ammoniac intracellulaire. Des réseaux de régulation impliquent des régulateurs dépendants des métaux (NikR et Fur) et un régulateur essentiel d'un système à deux composants (OmpR-like) dans cette réponse à l'environnement. Nous avons mis en évidence que de nombreux gènes impliqués entre autres dans la synthèse de la paroi, de la membrane et dans le métabolisme des métaux, avaient une expression dépendante de l'acidité. Enfin, nous avons observé que des mutants déficients dans Fur et/ou NikR sont atténués lors de la colonisation de l'estomac murin par H. pylori.

Métabolisme du peptidoglycane (PG) chez Helicobacter pylori (Catherine Chaput et Ivo G. Boneca)

Nous analysons, chez H. pylori, le rôle des hydrolases du PG dans la croissance, la morphologie et la tolérance aux antibiotiques. Trois hydrolases putatives Slt, MltD et AmiA ont été identifiées à partir des séquences génomiques : AmiA est impliquée dans la division cellulaire de H. pylori ainsi que dans la transformation morphologique de sa forme spiralée vers une forme coccoïde. Cette transformation s'accompagne de changements de la structure du PG qui ne se produisent plus dans le mutant amiA. AmiA est le premier déterminant génétique identifié chez H. pylori comme étant impliqué dans cette transition morphologique. Slt est nécessaire au relargage des fragments du PG et nous avons montré qu'un mutant slt est affecté dans sa capacité à induire une réponse inflammatoire sur les cellules épithéliales gastriques. Malgré une activité similaire, MltD aurait un rôle plus important dans le remodelage du PG en phase stationnaire et dans la transition en forme non-cultivable de H. pylori, une étape précédant la transition morphologique en coccoïde.

Rôle du peptidoglycane (PG) dans la réponse immune innée (Richard Ferrero, Catherine Chaput et Ivo G. Boneca)

En collaboration avec plusieurs équipes, nous avons montré que la reconnaissance des bactéries pathogènes passe par une détection du PG. Chez la Drosophile, cette reconnaissance est dépendante des PGRPs  (PeptidoGlycan Recognition Proteins). En collaboration avec Julien Royet (CNRS, Strasbourg) et Bruno Lemaitre (CNRS, Gif-sur-Yvette), les structures minimales du PG reconnues par la voie IMD, qui est spécifique pour les bactéries à Gram-négatif, ont pu être identifiées. Nous avons également montré que la reconnaissance des bactéries à Gram-positif par la voie dépendante des récepteurs TOLL, passe par une détection du PG et nécessite la participation de deux PGRPs, PGRP-SA et SD. Chez les mammifères, la reconnaissance du PG passe par les voies Nod1 et Nod2. Contrairement à ce qui était jusqu'alors admis, TLR2 n'est pas un récepteur du PG. En collaboration avec le groupe de Dana Philpott (Institut Pasteur), nous avons montré le rôle de Nod1 dans la reconnaissance de Helicobacter pylori, un pathogène exclusivement extracellulaire. Cette détection passe par la synthèse d'un système de sécrétion de type IV qui permet la translocation dans les cellules épithéliales des fragments du PG de H. pylori.

Réparation de l'ADN chez H. pylori (Aurélie Mathieu, Chantal Ecobichon, Eliette Touati et Agnès Labigne, en collaboration avec Pablo Radicella, CEA, Fontenay aux roses).

L'objectif de cette étude est de caractériser chez H. pylori les systèmes de réparation des lésions à l'ADN et leur contribution dans la genèse de la variabilité génétique des isolats cliniques. Chez H. pylori, la protéine MutS appartient à la famille MutS2. Elle ne présente pas de domaines de reconnaissance des mésappariements de bases et joue un rôle anti-recombinogène plutôt que réparateur. Le rôle de MutS2, dans la capacité des bactéries à acquérir de nouveaux caractères leur permettant une meilleure adaptation à des variations de leur environnement, est plus particulièrement analysé.

Génotoxicité liée à l'infection par H. pylori (Valérie Michel, José Ramos-Vivas et Eliette Touati en collaboration avec Michel Huerre et Patrick Ave)

Nos objectifs sont : i) de déterminer les événements précoces favorisant le développement de lésions précancéreuses au niveau de l'estomac au cours de l'infection par H. pylori, ii) d'identifier des facteurs de risque potentiels responsables de tels événements. Une activité mutagène liée à l'infection par H. pylori au niveau de la muqueuse gastrique a été précédemment mise en évidence dans le modèle de souris transgéniques " Big Blue " permettant de mesurer facilement la mutagenèse dans n'importe quel organe. Cet effet mutagène se traduit, entre autres, par l'induction de dommages oxydatifs, en particulier des 8oxo-guanines. Ces lésions sont spécifiquement réparées par l'ADN glycosylase OGG. L'influence d'une déficience dans cette enzyme sur la réponse mutagène et inflammatoire de l'hôte à l'infection est actuellement étudiée. Outre les radicaux libres produits par l'inflammation, les composés issus du métabolisme bactérien ou de l'alimentation (dérivés nitro/nitrosamines) contribuent également à la génotoxicité associée à l'infection. Des expériences sont en cours chez la souris mais aussi in vitro, afin de caractériser l'ensemble de ces différents adduits et événements d'instabilités génétiques, et de déterminer les mécanismes à l'origine de leur induction.

Génomique comparative des isolats cliniques de H. pylori (Jean-Michel Thiberge, Sébastien Breurec et Agnès Labigne en collaboration avec la plate-forme PT2 de la Génopole, et le GEFH, Groupe d'Etude Français des Helicobacter)

La génétique comparative d'un nombre restreint de souches de H. pylori (Hp) d'origines géographiques variées, avait permis de classer les gènes en deux catégories : les gènes ubiquistes (U, présents dans toutes les souches) et les gènes non-ubiquistes (NU). Nous avons étudié la distribution des gènes NU dans le génome de 120 souches recueillies en France et avons recherché l'association de marqueurs ou de profil d'hybridation en fonction des pathologies. L'analyse de la distribution des 213 gènes NU par souche montre que chaque souche a un profil d'hybridation unique. Les profils de distribution cumulée des gènes par pathologie diffèrent significativement. L'analyse en composantes principales (ACP) réalisées sur les valeurs normalisées permet de visualiser des structures sous-jacentes (classes) regroupant les souches associées à une même pathologie. Une classification hiérarchique utilisant les données relatives aux gènes les plus discriminatifs permet d'identifier trois sous-classes, l'une d'elles regroupant 77 % des souches associées aux lymphomes. Les souches associées au lymphome de MALT semblent avoir un contenu génétique différent de celui des souches associées aux autres pathologies, contenu qui pourrait jouer un rôle déterminant dans la physiopathologie de la prolifération des lymphocytes tumoraux.

Analyse génétique et moléculaire du génome des souches de H. pylori circulant au sein d'une famille (Josette Raymond, Jean-Michel Thiberge et Agnès Labigne en collaboration avec Catherine Dauga de la Génopole)

Dix colonies différentes ont été isolées à partir de cultures d'une biopsie antrale et d'une biopsie fundique de chacun des six membres (parents + 4 enfants) d'une famille souffrant de symptômes gastriques. Le séquençage des gènes glmM et hspA a permis d'identifier 4 associations différentes de ces deux alléles chez les souches du père, 2 pour la mère, 3 pour E1, E2 et E3 et une seule pour E4. Pour chacun des isolats portant des associations alléliques différentes, la présence ou l'absence de 213 gènes, définis préalablement comme étant des gènes non-ubiquistes, a été recherchée par hybridation sur puces à ADN. Sur la base des intensités et des profils d'hybridation, une classification hiérarchique des données montre que trois cores génomiques (C1, C2, C3) circulent dans la famille. Cette approche a permis de montrer qu'un nombre restreint de souches circulent à l'intérieur de la famille et que l'une d'elles est commune à la mère et à trois des enfants. La présence de mêmes combinaisons alléliques associées à des cores différents met en évidence des événements de recombinaison et d'échanges alléliques, ainsi que le brassage de souches d'origines géographiques différentes. Cette étude illustre au niveau moléculaire, l'évolution clonale d'une souche chez un même individu.

ESCHERICHIA COLI PATHOGÈNES

Bien que de très nombreuses espèces bactériennes soient à l'origine d'infections chez l'homme, ce sont les souches pathogènes de Escherichia coli qui sont responsables de la plupart de ces pathologies. E. coli représente un exemple de pathogène capable de provoquer des infections dans différents sites de l'organisme de l'hôte. Bien que certains facteurs de virulence soient retrouvés dans différents pathovars de E. coli, chaque pathovar possède une combinaison unique des facteurs de virulence dont la production conduit à un processus pathogène particulier. Nos objectifs sont d'élucider les mécanismes encore mal connus conduisant au développement de ces différentes infections. Pour cela, nous développons des approches de génétique, génomique et protéomique comparative de souches pathogènes et non pathogènes et d'épidémiologie.

Caractérisation de l'opéron deoK permettant l'utilisation du désoxyribose par les souches de E. coli. (Laurence du Merle, Samira Baghaz et Chantal Le Bouguénec, en collaboration avec les partenaires d'un programme transversal de recherche coordonné par C. Le Bouguénec).

Nous avons caractérisé l'îlot de pathogénicité présent dans l'isolat clinique AL862 associé à une septicémie. L'analyse de la séquence nucléotidique a permis d'identifier l'opéron deoK qui confère à la souche de E. coli la capacité d'utiliser le désoxyribose comme seule source de carbone. Une étude multicentrique, organisée sur trois sites (Sénégal, Roumanie, Centre Afrique), a permis d'étudier la distribution de l'opéron deoK chez E. coli. Les résultats d'une analyse multivariée sur 1152 souches pathogènes et non pathogènes ont révélé la fréquence plus grande des souches désoxyribose-positives chez les patients infectés. L'observation que la présence de cet opéron dans des cultures mixtes confère un avantage sélectif à la souche qui l'exprime confirme que le caractère désoxyribose peut être considéré comme un facteur de virulence.

Analyse structurale des adhésines Afa (Laurence du Merle, et Chantal Le Bouguénec, en collaboration avec Dr Matthews (Imperial College, Londres) et Dr Lea (Université d'Oxford).

Les opérons afa codent pour des adhésines et des invasines produites par des souches de E. coli associées à des diarrhées et des infections urinaires. Afin de mieux comprendre l'interaction bactérie-cellule eucaryote médiée par ces protéines Afa, la morphologie et le mode d'assemblage de la structure adhésive à la surface bactérienne ont été déterminés. La détermination de la structure cristalline de l'adhésine AfaE a permis de documenter son interaction avec le decay-accelerating factor, son récepteur cellulaire. Ces travaux qui ont également permis de comprendre les bases moléculaires de l'inhibition de ces adhésines par le chloramphénicol, ont fourni des bases importantes pour le design d'une nouvelle classe d'agents antibactériens.

Pathogénie des pyélonéphrites ascendantes (Christelle Chaudray et Chantal Le Bouguénec).

Les résultats obtenus suggèrent que de nombreux mécanismes physiopathologiques différents peuvent conduire au développement d'une pyélonéphrite et que certains isolats de E. coli peuvent être internalisés au niveau du rein.

Mots-clés: Helicobacter, gastrite, cancer gastrique, ulcère, lymphome, signalisation, acidité, peptidoglycane, muqueuse, inflammation, génomique, protéomique, régulation, uréase, nickel, adhésion, invasion, métabolome, Escherichia coli


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