Unité: Biologie des Interactions Cellulaires - CNRS URA 2582

Responsable: DAUTRY-VARSAT Alice

Les travaux de l'unité portent sur : 1) l'endocytose, le trafic intracellulaire et la signalisation de récepteurs membranaires du système immunitaire, récepteur à l'antigène des lymphocytes T et récepteurs d'une cytokine, l'interleukine 2 ; 2) les mécanismes d'entrée et de développement de Chlamydia, bactéries intracellulaires responsables principalement de pneumopathies, de maladies sexuellement transmises et de cécités.

1. DYNAMIQUE DES RECEPTEURS ET TRAFIC INTRACELLULAIRE (A. Alcover, A. Dautry-Varsat, F. Gesbert, N. Sauvonnet, S. Charrin, V. Das, M. I. Thoulouze)

Les récepteurs membranaires reconnaissent leur ligand extracellulaire et cette interaction est suivie d'un regroupement de récepteurs à la membrane puis de l'endocytose du complexe ligand-récepteur. Les récepteurs et ligands sont alors soumis à différentes étapes de tri dans les compartiments membranaires. Par ailleurs, les processus d'endocytose conduisent à des modifications d'expression, de fonction et de localisation des composants membranaires.

Les voies d'endocytose

Le mécanisme d'endocytose le mieux connu est celui qui implique d'abord la localisation des récepteurs dans des régions particulières de la membrane plasmique, les puits recouverts de clathrine. Ceux-ci se creusent pour former des vésicules intracellulaires qui transportent les complexes récepteur-ligand. Celles-ci fusionnent ensuite avec des compartiments membranaires intracellulaires, les endosomes.

Après avoir identifié l'interleukine 2 (IL-2) comme le premier ligand physiologique internalisé dans les lymphocytes par une nouvelle voie d'endocytose indépendante de la clathrine, nous avons recherché la voie d'endocytose du récepteur γc.

Le récepteur γc fait partie de la famille des récepteurs de cytokines. Il est partagé par les récepteurs de interleukine (IL-) 2, 4, 7, 9, 15 et IL-21 et joue un rôle majeur dans la prolifération et la différentiation lymphocytaires. Nous avons montré que d'endocytose du récepteur γ c est indépendante de la clathrine par interférence ARN contre la clathrine et à l'aide de mutants dominants négatifs de la protéine Eps15. D'autre part, cette voie nécessite la polymérisation d'actine et implique la protéine GTPase dynamine. La dyanmine est donc est impliquée dans la régulation des voies dépendantes et indépendantes de la clathrine

La dynamine est une protéine aux fonctions multiples qui interagit avec plusieurs protéines contrôlant l'organisation du cytosquelette d'actine à la membrane plasmique. Nous avons montré que, si l'on inhibe la polymérisation d'actine, l'endocytose de γc est inhibée.

Nous avons alors comparé le rôle dans l'endocytose clathrine-dépendante et indépendante des protéines qui interagissent à la fois avec la dynamine et le cytosquelette d'actine. Nous avons ainsi observé que l'intersectine, la syndapine et la protéine m-Abp 1, qui sont nécessaires dans l'endocytose clathrine-dépendante ne le sont pas dans le cas de l'entrée du récepteur γc. Ceci révèle le rôle ubiquitaire de la cortactine dans les processus d'endocytose et suggère qu'elle participe aux interactions entre la machinerie d'endocytose et le cytosquelette d'actine.

Le tri intracellulaire des récepteurs internalisés : rôle de l'ubiquitination

Après avoir atteint les endosomes, les récepteurs de l'IL2 sont triés pour être acheminés vers les lysosomes où ils sont dégradés. Nous avons observé que la chaîne β du récepteur est modifiée par une molécule d'ubiquitine et que cette ubiquitination joue un rôle clé dans le tri des récepteurs vers les endosomes tardifs/lysosomes. En conséquence, les mécanismes d'ubiquitination contrôlent la dégradation des récepteurs. Ceci montre que le système d'ubiquitination intervient dans le tri intracellulaire de récepteurs de cette cytokine, contrôlant ainsi leur expression à la surface. Nous étudions les molécules impliquées dans l'ubiquitination des différents composants des récepteurs ainsi que les mécanismes pouvant réguler cette ubiquitination.

Polarisation du récepteur à l'antigène des lymphocytes T et formation de la synapse immune: rôle du cytosquelette d'actine et du trafic vésiculaire intracellulaire.

Une étape fondamentale de la réponse immune est la reconnaissance par les lymphocytes T des antigènes exposés à la surface de cellules présentatrices d'antigène. Suite à la reconnaissance de l'antigène, le lymphocyte T se polarise vers la cellule présentatrice d'antigène et concentre à la jonction cellulaire le récepteur à l'antigène des lymphocytes T (récepteurs T), des molécules d'adhérence, du cytosquelette et de signalisation cellulaire. Cette jonction cellulaire organisée, a été appelée synapse immune. Nous étudions les mécanismes de formation de cette synapse ainsi que ses fonctions dans l'activation du lymphocyte T. Nous analysons, plus particulièrement, le rôle du cytosquelette d'actine et du trafic intracellulaire.

Nous avons montré que l'ezrine, une protéine qui lie la membrane plasmique et le cytosquelette d'actine, se polarise transitoirement vers la synapse immune (Figure 1). De plus, la sur-expression d'une forme tronquée de l'ezrine inhibe le rassemblement des récepteurs T à la synapse immune, ainsi que des étapes ultérieures de l'activation des lymphocytes T, comme l'activation du gène de l'IL2. Ces résultats montrent un rôle important pour l'ezrine dans les lymphocytes T : grâce à sa capacité à relier des composants membranaires au cytosquelette d'actine, l'ezrine pourrait contrôler la formation de la synapse immune et moduler le mécanisme d'activation des lymphocytes T.

Nous avons également montré que le trafic intracellulaire polarisé de vésicules endosomales est un processus clé pour la formation de la synapse immune. Ainsi, par microscopie confocale, microscopie en temps réel et analyse d'image quantitative, nous avons montré que des vésicules d'endocytose transportent vers la synapse immune des récepteurs T à partir d'autres endroits de la membrane cellulaire, facilitant ainsi leur polarisation (Figure 2). Des molécules qui contrôlent la fusion des vésicules de recyclage à la membrane plasmique, de la famille SNARE, son impliquées dans ce processus. Ces résultats montrent que le transport intracellulaire par des vésicules d'endocytose est un mécanisme clé pour la polarisation du récepteur T à la synapse immune et pourrait être impliqué dans le transport d'autres molécules.

2. Invasion DES CELLULES par Des bactéries INTRACELLULAIRES, LES Chlamydia (A. Dautry-Varsat, A. Subtil, M. E. Balañá, C. Delevoye, B. Wyplosz)

Les bactéries Chlamydia se développent exclusivement à l'intérieur d'une cellule-hôte. Trois espèces sont pathogènes pour l'homme et sont responsables essentiellement de pneumopathies, de maladies sexuellement transmissibles et du trachome. Les bactéries se multiplient dans un compartiment membranaire appelé inclusion, d'où elles sont capables de détourner à leur bénéfice les fonctions des cellules épithéliales qu'elles infectent. Les infections primaires sont très souvent relativement mineures, voire asymptomatiques. Les séquelles, cécité, stérilité, grossesse extra-utérine, apparaissent longtemps après l'infection. Tout le cycle intracellulaire des Chlamydia a lieu dans une vacuole délimitée par une membrane dans laquelle elles se différencient et prolifèrent (Figure 3). A la fin de ce cycle, la cellule est lysée et des formes infectieuses des bactéries sont libérées. Nous étudions les mécanismes par lesquels ces bactéries entrent dans les cellules, s'y développent et modifient les cellules-hôtes.

Le développement des Chlamydia dépend de leur aptitude à entrer dans les cellules, en particulier épithéliales, qui constituent leur cible principale. Nous nous sommes intéressés aux premières étapes de l'infection de cellules par Chlamydia (Figure 4). Nous avons observé une activation rapide de la polymérisation d'actine aux sites d'entrée des bactéries et nous avons décrit quelques-uns des événements qui ont lieu aux sites d'entrée dans les premières minutes de l'infection: concentration de micro domaines lipidiques, accumulation de protéines phosphorylées sur leurs résidus tyrosine. Nous avons recherché l'implication de petites protéines G de la famille Rho (Rho, Rac, Cdc 42), connues pour contrôler l'organisation du cytosquelette d'actine à la membrane cellulaire. Comme toutes les petites GTPases, ces protéines cyclent entre une conformation active, ayant lié le GTP, et une conformation inactive, ayant lié le GDP. Nous avons montré que les petites GTPases Cdc42 et Rac sont activées dès 5 minutes après attachement des bactéries, et ce de manière transitoire. L'expression de mutants dominants négatifs de ces protéines inhibe l'entrée des bactéries. Par contre, la protéine Rho n'est pas impliquée. L'utilisation d'inhibiteurs de la phosphatidyl-inositol 3-kinase a permis de montrer que l'activation de cette enzyme est nécessaire à l'internalisation de Chlamydia, probablement en aval des autres événements décrits. Ces résultats nous ont permis de proposer un modèle décrivant les premières étapes de l'invasion par Chlamydia, qui impliquerait des signalisations et l'activation très rapide de petites GTPases.

L'inclusion est un compartiment membranaire dont la taille augmente très rapidement au cours de l'infection (Figure 5). Cette membrane contient des lipides qui proviennent de la cellule-hôte. Elle reçoit également des protéines qui proviennent des bactéries qui prolifèrent à l'intérieur de l'inclusion. Nous avons démontré que les Chlamydia utilisent un système de sécrétion commun à différentes bactéries pathogènes pour sécréter des protéines à travers la membrane de l'inclusion. Nous développons actuellement une approche systématique pour rechercher les protéines sécrétées par ce type de mécanisme (dit de type III) dans la cellule-hôte au cours de l'infection. Nous avons identifié plusieurs protéines candidates dont la caractérisation est en cours. Il est très probable que ces protéines jouent un rôle important dans la pathogénicité des Chlamydia.

L'une de ces protéines, IncA, qui se trouve dans la membrane de l'inclusion, au contact du cytosol, a été particulièrement étudiée. Lorsqu'on exprime expérimentalement la protéine IncA dans une cellule hôte, le développement de l'inclusion est inhibée et cette inhibition n'est pas observée dans le cas où l'on utilise une souche de C. trachomatis qui n'exprime pas IncA. Lorsque IncA est exprimée dans la celle hôte, elle se trouve dans le réticulum endoplasmique. Sachant que la protéine IncA s'auto-associe, ceci montre que l'inhibition observée requiert des interactions entre molécules IncA dans l'inclusion et dans le réticulum endoplasmique. Par ailleurs, nous avons modélisé les tétramères de IncA en nous appuyant sur la structure du complexe SNARE, une structure conservée impliquée dans la fusion membranaire dans les cellules eucaryotes. Nous proposons que les protéines IncA auraient co-évolué avec la machinerie des complexes SNARE et pourraient être impliquées dans des phénomènes de fusion membranaire.

Figure 1. Lymphocyte T humain (Tc) interagissant avec une cellule qui présente un superantigène bactérien (APC). On observe par microscopie confocale l'ezrine, protéine associée au cytosquelette d'actine (rouge) et le récepteur à l'antigène du lymphocyte T (vert) qui sont polarisés vers la cellule présentatrice d'antigène (immunofluorescence ; figure de droite). A gauche, on observe la morphologie de ces deux cellules par contraste interférentiel.

Figure 2. Transport polarisé du récepteur T vers la synapse immune par des vésicules d'endocytose. Lymphocyte T humain (Tc) interagissant avec une cellule qui présente un superantigène bactérien (APC). Le récepteurs T présents dans des vésicules d'endocytose sont marqués par un anticorps fluorescent anti-récepteur T préalablement internalisé. La figure montre la superposition entre l'image de fluorescence (vert) et celle de contraste interférentiel (grise), permettant d'observer la polarisation et accumulation de vésicules qui contiennent le récepteur T dans la zone proche du contact cellulaire où se forme la synapse immune.

Figure 3. Schéma du cycle de développement de Chlamydia. L'intégralité du cycle se déroule dans une cellule hôte, en 48 à 72 heures. La forme infectieuse (EB) se différencie en forme proliférative (RB) qui se multiplie puis se différencie en EB en fin de cycle.

Figure 4. Chlamydia liée à la surface d'une cellule épithéliale observée en microscopie électronique à balayage. Les bactéries sont marquées avec des anticorps couplés à des billes d'or (points blancs sur la photo). Source : M. E. Balañá, avec M. C. Prévost et S. Giroux, (plate-forme de microscopie électronique, Institut Pasteur).

Figure 5. Schéma des interactions entre les bactéries et les cellules hôtes épitheliales. L'attachement aux cellules implique des microdomaines membranaires. Le cytosquelette d'actine est réorganisé et les bactéries entrent par phagocytose, ce qui s'accompagne de signalisation dans la cellule. Le mécanisme de sécrétion de type III se met rapidement en place. Les protéines Inc (triangles) qui sont à la membrane de l'inclusion sont des candidats intéressants qui pourraient être impliquées dans divers processus tels que: l'inhibition de la fusion de l'inclusion avec les lysosomes, la migration de l'inclusion le long des microtubules vers le centrosome, l'importation de nutriments et de lipides en provenance de la cellule hôte. D'autres protéines bactériennes sont sécrétées vers le cytosol (étoiles).

Mots-clés: Endocytose, trafic intracellulaire, récepteur de cytokines, récepteur de l'interleukine 2, récepteur à l'antigène des lymphocytes T, ezrine, cytosquelette d'actine, synapse immunologique, SNARE, Chlamydia, sécrétion bactérienne de type III, biologie cellulaire, immunologie


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