Unité: Retrovirologie Moléculaire

Responsable: WAIN-HOBSON Simon

L'Unité travaille autour de quatre projets dans les domaines suivants:

Immunopathologie du VIH, vaccination et mutation.

1. Mécanisme des hypermutations rétrovirales de type G->A induites par les membres de la APOBEC3 Rodolphe SUSPENE, Michel HENRY, Denise GUETARD, Jean-Pierre VARTANIAN

La Protéine Vif de VIH-1 bloque l'incorporation d'APOBEC3G et 3F dans les particules virales. APOBEC3G et 3F appartiennent à un locus localisé sur le chromosome 22 et comprenant 7 gènes (APOBEC3A, 3B, 3C, 3DE, 3F, 3G et 3H) .

Nous venons de mettre au point un système d'amplification par PCR permettant de sélectionner spécifiquement des séquences hypermutées de type G->A. Cette technique basée sur la température de dénaturation, nous a permis d'obtenir des hypermutations in vitro au sein de différents systèmes viraux comme HBV, HTLV et VIH-1 en présence des APOBEC3B, 3C, 3F et 3G. Ces hypermutations ont été également obtenues chez des patients infectées pour VIH-1 et HBV. Ces données nous montrent que quatre de ces cytidines désaminases sont fonctionnelles et désaminent dans des contextes nucléotidiques différents. Nous analysons à présent les différents domaines enzymatiques des APOBEC3 associées avec les hypermutations.

2. Stoechiométrie de l'infection par VIH-1 ex vivo et in vivo Rodolphe SUSPENE, Michel HENRY, Denise GUETARD et Jean-Pierre VARTANIAN

L'analyse par hybridation in situ par fluorescence (FISH) des splénocytes de 2 patients à différentes étapes de la maladie a montré qu'environ 75 à 80% des cellules infectées in vivo possèdent plus de 2 provirus, avec une moyenne de 3-4 copies provirales par cellule. L'analyse des populations virales après microdissection par laser des noyaux cellulaires possède une très grande hétérogénéité et les séquences obtenues montrent que ces virus VIH-1 sont génétiquement différents avec 29% de variation en acides aminés dans la région hypervariable V1-V2 de l'enveloppe virale. Il ressort de cette hétérogénéité virale la présence de virus mosaïques issus de recombinaisons multiples.

En utilisant des inhibiteurs du protéasome ainsi que de la voie endosomale/lysosomale, nous avons montré qu'une cellule in vivo est susceptible d'être infectée par au moins 300-400 virus génétiquement différents dont très peu seront intégrés et transcriptionellement actifs. Le mécanisme de cette intense variabilité obtenue au niveau d'une cellule reste à être établie. Cette étude permettra dans son ensemble de comprendre la genèse de cette intense variabilité avec notamment la présence de virus recombinants obtenue au niveau de la cellule.

3. Recherche d'une nouvelle forme d'atténuation du virus SIV, par échange de promoteur. Nicole CHENCINER, Philippe BLANCOU, Denise GUETARD

Parmi tous les immunogènes VIH/SIV obtenus par délétion de segments de gènes, seuls quelques vaccins vivants atténués protègent contre une épreuve intraveineuse par un isolat pathogène du SIV. L'échange du promoteur SIV par un autre promoteur viral ou cellulaire peut conférer de nouvelles propriétés au virus chimérique , telle que l'atténuation de la virulence. Si l'expression virale est déplacée vers d'autres types cellulaires (macrophages ou cellules dendritiques) que les lymphocytes T CD4+, l'aide apportée au système immunitaire pourrait aider à contenir l'infection. Nous avons principalement travaillé sur un virus chimérique dans lequel la région core du promoteur SIV située en 3'de nef et en 5' de TAR a été remplacée par le promoteur précoce du cytomégalovirus humain (CMV-IE). Le virus chimérique obtenu (SIV mégalo) pousse à bas titre in vivo -la médiane des titres de virémie sur 15 animaux est < 1000 copies /ml. Cela représente une réduction de 1000 fois du pic de virémie du virus parental. Lors d'épreuve par le virus pathogène SIVmac251, la virémie est 1000 fois inférieure à celle des contrôles naïfs (Blancou et al., J. Virol., Février 2004). Ces résultats confirment que le changement de promoteur peut atténuer le virus obtenu, de nouveaux promoteurs chimériques seront testés dans des études pilotes. Un suivi des singes infectés à long terme est réalisé pour déterminer les raisons de l'atténuation du SIV mégalo, la nature de la réponse immune induite et les lieux de réplication du virus .

Une nouvelle approche vaccinale fondée sur la production d'antigènes à long terme par l'épithélium des muqueuses du tractus génital est en cours d'étude. A cette fin, le promoteur LTR du clone moléculaire SIVmac239 a été changé par le promoteur du gène de l'involucrine qui est une protéine s'exprimant dans les couches superficielles des épithélium pluristratifiés. Ainsi la préparation vaccinale administrée à des Souris dans un premier temps par voie intradermique ou intravaginale s'intégrera dans les cellules souches de l'épithélium muqueux, mais étant sous la dépendance du promoteur de l'involucrine, n'exprimera les antigènes viraux que dans les couches superficielles des épithélium muqueux. Une telle stratégie devrait permettre le maintien des cellules ayant intégré la construction au niveau de la couche basale de l'épithélium alors que les cellules superficielles exprimeront et présenteront les antigènes viraux aux cellules de Langherans déclenchant une réponse immunitaire localisée au niveau des muqueuses. Les constructions moléculaires ont été réalisées et la caractérisation des virus produits est en cours.

4. Optimisation d'un polyépitope VIH-1 et caractérisation de la réponse cellulaire induite, à l'aide du modèle de souris transgéniques HHD. Développement d'une nouvelle stratégie vaccinale thérapeutique anti-VIH-1 dans des plantes transgéniques. Marie-MICHEL, Mireille CENTLIVRE et Monica SALA-SCHAEFFER

L'objectif principal de ce projet est d'améliorer quantitativement et qualitativement la réponse des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL) dirigée contre le VIH-1 chez les individus infectés. En effet, les CTL sont placés au cœur de la réponse immune dirigée contre le VIH-1. Cependant, ces CTL ne peuvent endiguer l'évolution de la maladie, ce qui suggère une déficience dans leur efficacité de lyse. Afin d'améliorer la réponse CTL chez les individus infectés, de nombreuses études ont porté sur la mise au point de polyépitopes du VIH-1 restreint aux allèles HLA de classe I, et en particulier HLA-A2.1, allèle présent dans le 40% de la population mondiale. Nous cherchons à dessiner des polyépitopes du VIH-1 et à les optimiser tant sur le plan nucléotidique que protéique afin de favoriser leur traduction, leur "processing" intracellulaire et leur présentation aux lymphocytes T CD8+. L'efficacité de ces polyépitopes dans l'induction d'une réponse CTL anti-VIH-1 efficace est évaluée dans le modèle animal de la souris HHD. En parallèle, en collaboration avec l'Université de Milan (Italie), nous avons développé une première génération de plantes transgéniques exprimant un polyépitope du VIH-1. Il existe actuellement dans le commerce des vaccins recombinants produits dans des organismes transgéniques telles que des bactéries, des levures et des lignées cellulaires de mammifères (exemple : vaccin contre l'HBV). Au vue des avancées biotechnologiques réalisées dans la mise au point de plantes transgéniques, celles-ci pourraient être également utilisées dans la production de dérivés immunogènes intégrés dans des produits végétaux comestibles tels que les fruits, des extraits de plantes ou des protéines purifiées, permettant ainsi leur administration par voie orale. Cette voie d'administration permet l'induction d'une réponse immunitaire au niveau des muqueuses et tout particulièrement du tissu lymphoïde associé à la muqueuse intestinale (GALT, Gut Associated Lymphoid Tissue). Le GALT contient 80 % des lymphocytes T CD4+ mémoires activés de l'individu, répartis entre la lamina propria et l'épithélium. Leur proportion y est donc bien plus importante que dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes. Dans la mesure où ce compartiment est un des sites préférentiels d'infection et de réplication du VIH-1, il est nécessaire de cibler ce tissu dans le développement d'un vaccin préventif et thérapeutique.

5. Le promoteur du VIH-1 joue un rôle important dans la dynamique de colonisation de différents compartiments tissulaires de l'hôte. Mireille CENTLIVRE, Marie MICHEL, Simon WAIN-HOBSON et Monica SALA-SCHAEFFER

Dans une étude sous-presse à Journal of Clinical Investigation en 2005, nous avons montré in vivo que le polymorphisme des promoteurs sous-type-spécifiques du VIH-1 se traduit par des phénotypes différentiels marqués de la réplication virale, dépendant de l'environnement tissulaire dans lequel le virus se réplique. Pour développer cette étude, nous avons construit des virus chimères VIS dans lesquels le génome VIS porte les fonctions Nef et LTR dissociées (STR), ainsi que des promoteurs ciblés : la région promotrice/activatrice des sous-types B, C et E du VIH-1. Ces chimères ont été caractérisées in vitro par des cinétiques de réplication et de compétition. Puis, deux macaques Rhésus ont été co-infectés avec les trois chimères et les paramètres classiques de suivie de l'infection par VIS ont été déterminés sur huit mois. Les données obtenues ont montré que dans les rPBMC (peripheral blood mononulcear cells) et dans les ganglions périphériques le provirus prédominant est le virus STR portant le promoteur du VIH-1 de sous-type B (STR-B). En revanche, les virus présents dans le sang circulant sont majoritairement les STR-C et -E. Nous avons analysé la distribution des chimères dans les ganglions lymphatiques périphériques aux semaines 10, 22 et 31 post-infection. Dans ce compartiment, nous observons, comme dans les rPBMC, une prédominance du STR-B. Nous avons séquencé les échantillons des semaines 10, 22 et 31 provenant des ganglions, des rPBMC et du sérum et nous n'observons aucune mutation dans la région promotrice rearrangée montrant que la configuration VIS-STR est génétiquement stable in vivo. Durant les huit mois d'infection, l'accès aux compartiments de l'organisme était limité. Lors du sacrifice, nous avons pu analyser la distribution des différents chimères STR dans de nombreux types de tissus lymphoides secondaires et non-lymphoides. Nous avons ainsi pu mettre en évidence que, bien que le virus STR-B prédomine dans tous les tissus analysés, le STR-C et de façon plus faible le STR-E persistent dans tous les organes.

Pour déterminer la source principale de production du STR-C en primo-infection, nous avons co-infecté deux nouveaux macaques Rhésus avec les trois virus chimères STR-B, -C, et -E et sacrifié ces deux animaux 18 jours post-infection. Le suivi des animaux sur 18 jours nous a permis de confirmer les résultats obtenus précédemment en primo-infection: le STR-C prédomine dans le sérum jusqu'à 18 jours post-infection tandis que le STR-B domine dans les rPBMC. L'analyse de différents compartiments tissulaires est en cours et elle va maintenant nous permettre d'identifier la source principale de production du STR-C en primo-infection et de formuler un modèle sur la dynamique temporale et spatiale du virus dans la colonisation des différents compartiments de l'hôte.

Mots-clés: VIS, VIH, vaccin, infections multiples, APOBEC3, deamination cytidine


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