Unité: Régulation de la traduction eucaryote et virale - CNRS URA 1966

Responsable: KEAN, Katherine M.

La régulation de l'expression génétique au niveau de la synthèse protéique (traduction) est un phénomène d'une grande importance. On définit aussi bien une modulation globale, selon les conditions environnementales, qu'une régulation spécifique, par l'utilisation des mécanismes variants et alternatifs pour la traduction des sous populations d'ARNm. Des exemples clairs de la régulation spécifique de la traduction sont fournis par le changement abrupt du profil de la synthèse protéique dans des cellules infectées par de nombreux virus : le pathogène subvertit presque toute la machinerie cellulaire de la traduction à son propre profit, au dépens de la majorité des ARNm cellulaires. Les objectifs généraux de notre recherche sont dirigés vers l'étape de l'initiation de la traduction, particulièrement le contact initial entre la sous-unité ribosomique 40S et l'ARNm. Nous abordons notre recherche par une combinaison de techniques de la virologie, spécifiquement la génétique moléculaire, la biochimie, la génomique fonctionnel et la biologie cellulaire pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la synthèse protéique par le ribosome eucayote et la régulation de la traduction selon la structure de l'ARN et lors de l'infection par des virus à ARN.

1) Développement des systèmes modèles d'étude in vitro qui récapitule des propriétés de traduction/conditions physiologiques du mammifère

Notre but est de simplifier les études de phénomènes/mécanismes en utilisant des cellules en culture plutôt que des organismes entiers, ou des systèmes de traduction dans un tube à essai programme avec un seul ARNm plutôt que l'environnement cellulaire complexe de plusieurs dizaines de milliers d'ARNm. En gros, en commencant avec un modèle qui donne des résultats discordants entre un système simplifié et l'in vivo, le système de traduction simplifié est modifié progressivement, pour mieux comprendre les exigences et/ou contraintes qui affectent le phénomène à l'étude. Notre objectif principal cette année a été d'étudier la traduction du virus de l'hépatite C (VHC) dont le génome présente des régions non traduites 5' et 3' longues, structurées et conservées parmi différentes souches. En particulier, à la différence d'un ARNm cellulaire classique, la région 5' comporte un IRES (Signal d'Entrée Interne des Ribosomes) et l'extrémité 3' terminale une structure de 98 nucléotides en forme de feuille de trèfle, notée X, au lieu d'une queue poly(A). Trois systèmes modèles sont actuellement utilisés/en cours de développement :

i) Etude de la traduction dans des cellules en culture

Ici, c'est le système de traduction lui-même qui est à l'étude actuellement, avec une attention particulière aux effets sur la traduction des changements de la concentration en oxygène lors de la culture cellulaire. En effet, le plupart des recherches effectuées en culture cellulaire utilisent une pression en oxygène équivalent à la pression atmosphérique (21 % d'oxygène, ou 159 mmHg). Or il est connu que les organes de mammifères sont soumis à une pression de 3 à 5 % d'oxygène (35 à 40 mmHg) et il a été montré que les hépatocytes, cibles principales de l'infection par le VHC, sont soumis à une pression en oxygène encore plus faible. Lorsque les cellules sont cultivées en normoxie expérimentale (5 à 1% d'oxygène) on observe une diminution notable de la traduction classique, mais le maintien de la traduction coiffe-indépendante et surtout l'expression de facteurs de transcription spécifiques à cette condition, invoquant l'idée d'un contexte cellulaire protéique particulier. On est en droit de se demander si le profil d'expression génique en normoxie expérimentale et en normoxie tissulaire engendre un contexte favorable au mécanisme propre à la traduction du génome VHC.

Nos études de la traduction dans des cellules en culture seront grandement facilitées par l'adaptation de la technologie puces à ADN pour l'analyse spécifiquement des ARNm polysomaux humains (Collaboration avec la plate-forme Micropuces au Génopole de l'Institut). Nous avons mis au point un protocole qui donne une quantité et une qualité d'ARN total satisfaisantes, même lorsque l'ARN est isolé des cellules Huh7 en normoxie. En revanche, le protocole élaboré pour isoler les ARNm polysomaux n'est pas adéquat quantitativement pour accommoder la baisse attendu dans les cellules cultivées en normoxie expérimentale. Pour augmenter le rendement de l'ARN polysomal, nous avons inclus dans le protocole une étape d'amplification quantificative à l'étape de synthèse du cADN marqué. La nature innovatrice de notre approche est la mise au point d'un protocole totalement nouveau d'amplification de l'ARN, conçu pour permettre l'amplification de tout ARN indépendant de sa taille et de la nature des séquences non codantes.

ii) Etude de la communication 5'-3' de l'ARN, ou synergie

Nous avons déjà décrit le développement d'un système de traduction in vitro basé sur le lysat de réticulocytes de lapin, et déplété partiellement en ribosomes, qui récapitule le synergie 5'-coiffe/3'-poly(A) observée in vivo qui est à la base du modèle de l'initiation de la traduction eucaryote d'ARN en boucle fermé. Ce système de traduction nous a permis de montrer que la traduction efficace de l'ARN du VHC dépend également du modèle de boucle fermée qui fait intervenir l'IRES en 5' et la région X en 3'. Après avoir montré que la région X module la traduction en fonction de la séquence précise de l'IRES, nous avons regardé l'effet de mutations dans X sur ces mêmes IRES variants. Nous avons constaté que des mutations dans la région X peuvent avoir des conséquences variables sur l'efficacité de la traduction en fonction de la séquence de l'IRES considéré. Nous cherchons à connaître les changements de structure de l'ARN qui peuvent expliquer ces modulations traductionnelles. Pour les mêmes raisons, nous avons entrepris de regarder si des différences d'affinité existent entre la protéine PTB (Polypyrimidine Tract Binding protein) et les différentes régions X mutantes. Notre hypothèse est que PTB fixé normalement sur la région X ainsi que sur l'IRES du VHC sert de lien critique afin de favoriser une pseudocircularisation de l'ARN et par là-même une traduction plus efficace.

Par ailleurs, nous avons constaté que la synergie observée dans des cellules Huh7 peut atteindre un niveau environ 100 fois plus important que celle constaté in vitro dans les lysats de réticulocytes de lapin déplétés en ribosomes. Ainsi, actuellement, nous recherchons l'existence de facteurs intervenant dans la réponse de l'IRES du VHC à la région X qui seraient limitants dans le lysat de réticulocyte de lapin.

iii) Etude de la production de la protéine F du VHC

Le début de la région codante du VHC qui code la protéine structurale "core" contient un deuxième cadre de lecture ouverte dans la position +1. La protéine F qui pourrait être encodé dans ce cadre de lecture alternative est effectivement exprimée lors de l'infection naturelle chez l'homme, comme témoigne la présence des anticorps spécifiques circulants chez des patients. Plusieurs résultats montrent que la synthèse in vivo de cette protéine n'a pas lieu par le même mécanisme qu'in vitro où un simple changement de cadre de lecture contrôlé au cours de l'élongation ("frameshifting") ne demande que les codons 8 à 14 de la région codante du VHC. Cependant, le mécanisme de production de la protéine F in vivo reste à clarifier. Nous avons testé la synthèse de la protéine F dans le lysat de réticulocyte de lapin déplété partiellement de ribosomes, et ceci s'avère non adéquate pour reproduire les résultats obtenus in vivo. Nous sommes en cours d'établir un système de traduction in vitro alternatif qui permettra d'étudier ce phénomène.

2) Etude de la synthèse de la protéine M du virus de la rage (coll. Y. Jacob, dept. Virologie)

Il est connu que la protéine de matrice (M) du virus de la rage diminue la transcription virale tout en stimulant la réplication virale. Utilisant un criblage double hybride de la levure avec une banque de cADN de cerveau humain, nous avons identifié la sous-unité p40 du complexe eIF3 comme partenaire cellulaire de la protéine M du virus de la rage. Cette interaction a été confirmée par co-immunoprécipitation des deux protéines. Nous avons trouvé précédemment que la traduction d'un ARNm qui code M était 5 fois moindre in vitro que celle des ARNm témoins avec les mêmes régions non codantes. Ainsi, nous avons proposé une inhibition autorégulatrice de la protéine M sur sa propre synthèse. Cependant, nous trouvons maintenant que la synergie coiffe-poly(A) peut être mis en évidence sur l'ARNm de la protéine M dans un lysat de réticulocyte complet, un système qui est normalement synergique qu'en présence d'ARNm compétiteurs endogènes. De plus, lors de la traduction des ARNm bicistroniques avec l'IRES du poliovirus comme espaceur intercistronique, M n'inhibe ni la traduction du deuxième cistron, ni sa propre synthèse. Ainsi, le(s) mécanisme(s) de traduction in vitro de la protéine M sont plus complexes que nous avions pensé, et d'autres études sont nécessaire pour mieux comprendre la régulation de la traduction de M et le rôle de l'interaction M-eIF3.

3) Etudes des IRES des entérovirus

Pendant les quatre dernières années, nous avons acquis une compréhension solide concernant la relation structure-fonction du domaine E de l'IRES du poliovirus, notamment la corrélation entre un phénotype d'atténuation neuronale et des mutations dans ce domaine de l'ARN. Maintenant, nous avons modélisé la séquence du coxackievirus B3 (un virus cardiotrophe apparenté au poliovirus) sur le structure de l'ARN du poliovirus, et nous avons commencé a introduire les mutations équivalentes à celles du poliovirus dans le génome du coxackievirus B3. L'objectif de ce travail est de déterminer si des modifications structurales du domaine E de l'IRES peuvent servir dans la conception de vaccins généralisés contre tout entérovirus (collaboration avec J.Gharbi, Monastir, Tunisie).

Un autre aspect important de notre travail actuel sur les entérovirus concerne les isolats naturels de ECHOvirus 30 récolté lors d'une épidémie de méningite (collaboration avec J-L. Bailly, Clermont-Ferrand). La structure secondaire du domaine E de l'IRES de tout entérovirus rapporté jusqu'à maintenant comprend une grande boucle latérale de 14 nucléotides, hautement conservée. Or, dans un groupe de ces ECHOvirus 30, cette boucle latérale est refermée pour former une petite branche tige. Nous avons trouvé que ce changement est corrélé avec l'initiation de la traduction en partie à un deuxième codon AUG, en amont du codon authentique d'initiation, et dans le même cadre de lecture. De plus, nous constatons un changement dans la concentration optimale en KCl pour la traduction in vitro entre l'ARN polyadenylé et l'ARN nonpolyadenylé. Ceci suggère un changement dans des interactions protéine-ARN ou dans les protéines requises pour la traduction, selon la présence ou non de la queue poly(A).

Mots-clés: virus à ARN, Initiation de la traduction, IRES, ARN structure-fonction, co-opération ARNm 5’-3’


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