Unité: Régulations Transcriptionnelles - CNRS URA 2172

Responsable: Kolb, Annie

Notre objectif est de caractériser les modifications de l'expression génétique en réponse aux carences et aux stress. σS, le facteur σ de phase stationnaire de l'ARN polymérase, codé par le gène rpoS, joue un rôle clef dans la survie en phase stationnaire et la réponse généralisée au stress. Nos études portent sur l'analyse fonctionnelle du régulon rpoS chez Salmonella avec l'isolement et la caractérisation de mutants de gènes sensibles à σS et l'étude mécanistique de la reconnaissance des promoteurs dépendant de σS.

Le facteur σS de l'ARN polymérase

Le démarrage de la transcription est la première étape de l'expression génique et la cible de nombreuses régulations. L'holoenzyme bactérienne est composée de l'enzyme cœur E et d'un facteur σ responsable de la liaison au promoteur. Les entérobactéries Escherichia coli et Salmonella enterica possèdent 7 facteurs σ qui entrent en compétition pour la fixation à l'enzyme cœur. σ70 assure la transcription pour toutes les fonctions essentielles de la cellule. A l'entrée en phase stationnaire et en réponse à de nombreux stress, apparaît le facteur σS, appelé aussi σ38. σS contrôle la transcription de plus de 100 gènes impliqués dans la résistance aux variations de pH, au choc osmotique et au stress oxydatif ainsi que dans le développement des biofilms et le contrôle de la virulence. A ce jour, plus de la moitié des gènes dépendant de σS n'ont pas de fonction précise connue.

Identification et analyse fonctionnelle des gènes du régulon rpoS de Salmonella (F. Norel, V. Robbe-Saule)

σS est essentiel à la virulence et la persistance de Salmonella enterica sérotype Typhimurium, un pathogène intracellulaire facultatif qui cause des maladies sévères chez l'homme et les animaux. Notre objectif est de mieux comprendre les fonctions du régulon rpoS dans la physiologie et le pouvoir pathogène de Salmonella et d'identifier les fonctions clés de sa survie dans l'environnement inerte et biologique. Nous avons isolé des mutants de S. Typhimurium contenant des fusions de gènes activées par σS. L'identification des gènes mutés montre que la composition du régulon rpoS de Salmonella diverge significativement de celle du régulon rpoS de E. coli K12 puisque plus d'un tiers des gènes de Salmonella ainsi identifiés est absent chez E. coli K12. Plus de la moitié des gènes identifiés est de fonction inconnue et en cours de caractérisation. Parmi ces gènes, le gène katN, absent chez coli K12, mais conservé chez E. coli entérohémorrhagique O157, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa, code pour une catalase non-héminique de phase stationnaire. D'autres gènes pourraient participer au métabolisme bactérien, probablement dans des conditions de croissance sub-optimales proches de celles rencontrées dans les habitats naturels.

Reconnaissance des promoteurs par les ARN polymérases EσS et Eσ70 ( A. Kolb)

σS et σ70 sont très homologues au niveau de leur séquence et de leur structure et la discrimination entre promoteurs dépendant de σS ou de σ70 reste un sujet d'étude. De nombreux promoteurs sont reconnus in vitro par les deux formes d'holoenzyme Eσ70 et EσS, avec toutefois des affinités et des cinétiques différentes. Les promoteurs qui dépendent de σS in vivo sont en général des promoteurs faibles ; la plupart sont dépourvus d'hexamère -35 consensus, mais possèdent la même séquence optimale pour la boîte -10 (TATAA/CT) que ceux dépendant de σ70. Cependant, à la différence de Eσ70, EσS a la possibilité de reconnaître une cytosine ou une thymine en position -12 et montre une forte préférence pour une cytosine en position -13. L'utilisation de mutants suppresseurs et la mutagenèse dirigée nous ont permis de montrer avec l'équipe de C. Gutierrez à Toulouse que deux acides aminés de la région 2.4 de σS (Q152 et E155) déterminent au moins partiellement la préférence de σS pour la cytosine en position -13 du promoteur. Il faut noter que les acides aminés homologues de σ70 (Q437 et T440) contribuent à établir la forte préférence pour la thymine en position -12 dans le cas de σ70. Les substitutions Q437H et T440E permettent à Eσ70 de reconnaître plus efficacement le promoteur aidB, un promoteur dépendant de σS que nous étudions avec le groupe de P. Landini (Dubendorf-Suisse). Ce résultat suggère que deux acides aminés homologues de σS et de σ 70 pourraient être impliqués dans la reconnaissance de paires de bases différentes, mais adjacentes dans un jeu complexe d'interactions.

Les éléments régulateurs de l'activité de σS (V. Jaumouillé, H . Mahtout, N. Miroslavova, F. Norel, V. Robbe-Saule)

En phase stationnaire, σS reste toujours moins abondant que σ70. L'enzyme cœur, en quantité limitante dans la cellule, a une affinité nettement plus forte pour σ70 que pour σS. Il existe donc in vivo des facteurs qui permettent à σS de capturer suffisamment d'enzyme cœur pour assurer la transcription des promoteurs dépendants de σS, soit en augmentant la fixation de E à σS (facteurs"pro-σS"), soit en diminuant celle à σ70 (anti-σ70). Notre objectif est de caractériser ces facteurs sur le plan fonctionnel et biochimique. La protéine Rsd, exprimée à l'entrée en phase stationnaire, se lie à la région 4 de σ70, comme le facteur anti-σ 70 du phage T4, mais avec une affinité bien plus faible. A la différence de AsiA, Rsd est capable de dissocier in vitro l'holoenzyme Eσ70 et ainsi de favoriser l'association de E et de σS. De plus, nous avons montré que la protéine Crl de Salmonella qui fixe σS, active directement la transcription médiée par σS in vitro, selon un mécanisme qui reste encore à préciser et dont l'efficacité pourrait varier selon les promoteurs. Nous cherchons également à appréhender la finalité biologique de la fonction régulatrice de Crl chez Salmonella en évaluant son rôle dans l'expression de phénotypes dépendant de σS (virulence, résistance au stress). En parallèle, deux approches globales, l'une, phénotypique (phénotypes arrays Biolog), et l'autre, protéomique, sont développées afin d'évaluer le degré de recouvrement entre les régulons Crl et RpoS. Nous avons observé un rôle de Crl dans le développement du morphotype "rdar" de Salmonella (aspect "red dry and rough" des colonies sur milieu au rouge Congo à faible osmolarité et faible température), un état d'agrégation multicellulaire dû à la production d'une matrice extracellulaire composée en particulier de petits fimbriae (curli) et de cellulose. La production de cette matrice dépend de σS et est corrélée à la formation de biofilms dans certaines conditions. Nous cherchons à déterminer plus précisément le rôle de Crl dans le développement de ce morphotype et dans la formation de biofilms.

Régulation du promoteur dépendant de σ54 glnAP2 par la courbure de l'ADN induite par le complexe CRP-AMP cyclique (Y. Huo, collaboration avec Y-P Wang, Université de Pékin)

Le facteur σ54 diffère des autres facteurs σ par sa séquence et son mode d'action. L'holoenzyme Eσ54 requiert un activateur fixé à des distances parfois considérables en amont du promoteur pour former le complexe ouvert. La formation d'une boucle d'ADN assure les contacts entre Eσ54 et l'activateur. L'introduction d'une courbure d'ADN induite par la fixation de la protéine (CRPH159L-AMPc) à différentes positions entre le site de l'activateur et le promoteur, mais sans modifier la distance entre les deux, conduit à une augmentation ou une réduction de l'activité du promoteur en phase avec le pas de la double hélice d'ADN. Cette observation nous a permis de préciser l'orientation de l'activateur et de Eσ54 dans le complexe de préinitiation.

Mécanisme d'activation des gènes de résistance à la vancomycine chez Enterococcus faecalis BM454 par la protéine VanRB (F. Depardieu , P. Courvalin, Unité des Agents Antibactériens, et A. Kolb)

La présence de vancomycine permet la phosphorylation par la protéine "senseur" VanSB du régulateur VanRB ainsi que sa dimérisation. VanRB-P régule positivement l'expression des gènes régulateurs (vanRBSB) à partir d'un site de fixation situé en position -32.5 par rapport au démarrage de la transcription. VanRB-P possède deux autres sites en amont des gènes de résistance (vanYBWHBBXB) en position -33.5 et - 55.5 en amont de l'origine du transcrit vanY. L'activation de la transcription par vanRB-P est observée dans un système in vitro avec l'ARN polymérase d' E. coli70.

Légende
Figure 1 : Rôle de σS et Crl dans l'état d'agrégation des colonies de S. Typhimurium ATCC14028, poussées sur milieu rouge Congo à faible température et faible osmolarité. (A) La souche sauvage présente le morphotype dit "rdar" pour son aspect "red dry and rough"; (B) ΔrpoS::cm; (C) Δcrl:: cm

Mots-clés: ARN polymérase, Salmonella, phase stationnaire, sigma, anti-sigma, protéine réceptrice de l’AMP cyclique (CRP), MICROBIOLOGIE MOLECULAIRE, BIOCHIMIE


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