Unité: Cristallogenèse et Diffraction des rayons X (Plate-forme)

Responsable: ALZARI, Pedro M.

L'objectif de la plate-forme est de mettre à disposition des équipes de cristallographie sur le campus l'ensemble des équipements pour la cristallogenèse, l'informatique et la diffraction des rayons X, et de développer des méthodologies à haut débit pour le clonage, la production et la cristallisation de protéines, grâce à l'automatisation et à la miniaturisation des différentes étapes du processus. Au cours des dernières 18 mois, plus d'une centaine de protéines ont été soumises à des essais automatiques de cristallogenèse, avec un taux de réussite d'environ 33%. La plupart de ces essais (60%) correspondent au projet de génomique structurale des mycobactéries décrit ci-dessous, alors que le reste viennent de différents laboratoires de cristallographie sur le campus ou de collaborations de la PF6 avec des biologistes.

Génomique Structurale des Mycobactéries

Grâce au soutien du Réseau National des Génopoles, des projets européens X-TB et SPINE, et de l'Institut Pasteur, nous avons entrepris un projet de génomique structurale de mycobactéries. Le choix initial de cibles s'appuie sur l'analyse comparative des génomes de M. tuberculosis et M. leprae. Ces cibles incluent, d'une part, des protéines impliquées dans la croissance bactérienne et/ou la virulence des mycobactéries, mais elles incluent aussi un nombre important de protéines de fonction inconnue dont l'analyse génomique suggère leur importance comme cibles thérapeutiques. A présent, 356 gènes mycobactériens ont été clonés dans des vecteurs d'expression bactériens, 115 protéines exprimées sous une forme soluble et 65 protéines purifiées et soumises à des essais de cristallisation. Une difficulté majeure de ces études est que seul un tiers des protéines exprimées s'obtiennent sous forme soluble. Nous utilisons différentes aproches pour adresser ce problème, incluant le clonage de gènes orthologues issus d'autres génomes mycobactériens (M. leprae, M. smegmatis) ou l'optimisation des conditions d'expression en utilisant des systèmes acellulaires. A présent, nous avons obtenu des cristaux pour plus d'une vingtaine de protéines mycobactériennes, nous avons déterminé 11 structures tridimensionnelles (incluant plusieurs de fonction inconnue, Figure 1) et enregistré des données de diffraction pour trois autres. L'état actuel du projet est décrit dans la page Web " Structural Genomics of Mycobacteria " (http://www.pasteur.fr/SGM)

Autres projets en cours

Au cours de cette année, la PF6 a commencé à collaborer dans d'autres projets visant l'analyse cristallographique de protéines et de complexes protéine-ligands. Ces études incluent plusieurs protéines impliquées dans la metacyclogenèse de Trypanosoma cruzi (projet Amsud-Pasteur), protéines secrétées de Chlamydia, de fonction inconnue et qui pourraient être impliquées dans la pathogénicité (coll. A. Dautry, IP), anticorps anti-LPS de V. cholerae (coll. J. M. Fournier, IP), l'UMP-CMP humaine complexée à des inhibiteurs (coll. D. Deville-Bonne, IP), les sérine protéases SUB1/2 de P. falciparum (coll. J.C. Barale, PTR, IP), la TMPK de M. tuberculosis complexée à des inhibiteurs (coll. H. Munier-Lehmann, IP) et la kinase Yak1 de Candida (coll. G. Janbon, PTR, IP).

Figure: Trois protéines de fonction inconnue de M. tuberculosis

Mots-clés: genomique structurale, purification de protéines, cristallogenèse, diffraction des rayons-X, LIMS


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