Unité: Cyanobactéries - CNRS URA 2172

Responsable: TANDEAU de MARSAC Nicole

Les cyanobactéries sont à l'origine de l'apparition de l'oxygène sur notre planète, il y a plus de 3 milliards d'années. Par leur activité photosynthétique, elles participent, encore de nos jours, au maintien de l'équilibre des proportions entre le CO2 et l'oxygène dans l'atmosphère. Adaptées à des environnements variés, mêmes extrêmes, elles colonisent la plupart des écosystèmes aquatiques et terrestres. Certaines d'entre elles forment des efflorescences responsables de dysfonctionnements dans les écosystèmes et synthétisent des métabolites secondaires (hépatotoxines et neurotoxines) toxiques pour l'Homme et l'animal. L'objectif de nos travaux de recherche est de développer, par une approche pluridisciplinaire, notre connaissance de la biodiversité, du génome et de la physiologie des cyanobactéries, afin d'élucider leurs modes d'adaptation à l'environnement et les bases de leur toxicité, et également d'exploiter leurs potentialités biotechnologiques.

1. La PCC ou "Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria"

La PCC est internationalement reconnue tant pour la qualité (cultures axéniques) que pour la diversité des propriétés morphologiques et physiologiques de ses souches.

Les missions de la PCC comprennent à la fois des activités de service et de recherche :

Préservation et accroissement des ressources biologiques (R. Rippka, I. Iteman, K. Comte, M. Herdman, T. Coursin et T. Laurent)

La PCC comprend 750 souches représentant 57 genres ; 475 souches sont disponibles sur catalogue (http://www.pasteur.fr/recherche/banques/PCC/). Dans l'optique d'une intégration de la PCC dans le Centre de Ressources Biologiques de l'Institut Pasteur (CRBIP), la mise en place du contrôle qualité est en cours. Dans le cadre du projet européen COBRA "The Conservation of a vital european scientific and biotechnological resource: microalgae and cyanobacteria" (http://www.cobra.ac.uk/) plusieurs techniques de cryoconservation ont été testées, y compris en présence d'antioxydants (α-tocophérol ou desferrioxamine), confirmant la sensibilité des souches du genre Arthrospira ("Spiruline") à la congélation. Différentes méthodes de génotypage ont été appliquées à des cyanobactéries de la PCC des genres Arthrospira, Spirulina, Planktothrix, Microcystis et Nostoc, afin de préciser leur identité génétique, ainsi qu'à des souches de "Phormidium" récemment isolées de milieux extrêmes (Coll. J. Elster et M. Sabacka, University of South Bohemia, Trebon, République Tchèque). Des isolats de la région Arctique se sont avérés phylogénétiquement très proches de certaines souches de l'Antarctique ce qui implique vraisemblablement une dissémination accidentelle par l'Homme ou la migration d'oiseaux entre les deux pôles.

Distribution et ventes de souches (R. Rippka)

En 2004, 236 souches ont été envoyées à des laboratoires de recherche et des industriels dans le monde entier, ainsi que pour l'enseignement en France. Une importante activité de conseil est également associée à la PCC.

Activité d'expertise (I. Iteman et T. Laurent)

Cette activité inclut l'identification des cyanobactéries et le dosage des hépatotoxines dans les eaux de surface (Coll. J.M. Delattre, Institut Pasteur de Lille). En 2004, une centaine d'expertises (soit le double par rapport à 2003) a été faite pour des DDASS de diverses régions de France. La surveillance des plans d'eau pour la présence de cyanobactéries potentiellement toxiques s'accroît très sensiblement depuis la publication de la circulaire DGS relative au contrôle sanitaire des eaux de baignade.

Bases de données (I. Iteman, R. Rippka et M. Herdman)

"CYANOBANK" (Windows 98, Microsoft Access) : propriétés des souches de la PCC ; "ITS size database" : nombre et taille des amplicons des ITS (300 entrées) ; "Photographic database" (610 entrées) ; "Storage database" : inventaire des souches conservées dans l'azote liquide ; les trois derniers modules interagissent avec CYANOBANK. D'autres bases de données sont indépendantes de CYANOBANK : "ITS sequence database" avec ~300 séquences d'ITS de cyanobactéries alignées ; "Cyanobacterial 16S rRNA sequence database", maintenue sous le logiciel ARB avec plus de 900 séquences alignées ; "Bacterial 16S rRNA sequence database", qui permet de choisir des amorces oligonucléotidiques ou des sondes et comprend plus de 13000 séquences ; bases de données (sous GelCompare) des profils RFLP des ITS et des profils obtenus par amplification avec des amorces basées sur les séquences HIP1 ; banque photographique (~700 entrées) basée sur l'observation d'échantillons naturels. La très grande majorité des données concernant les propriétés des souches de la PCC ont été transférées de "CYANOBANK" dans une nouvelle base de données commune aux collections du CRBIP et une nouvelle édition du catalogue de la PCC va paraître en 2005.

Valorisation par la recherche et la caractérisation de métabolites secondaires, toxiques ou bioactifs

- Alcaloïdes neurotoxiques (A. Méjean, C. Monard et I. Iteman). Les cyanobactéries synthétisent différents types d'alcaloïdes neurotoxiques mortels pour les animaux et dangereux pour l'Homme. Comme cela a été montré antérieurement au laboratoire par R. Araoz et coll. (Microbiology, sous presse), trois souches de la PCC du genre Oscillatoria synthétisent de l'anatoxine-a et deux autres sont capables de synthétiser de l'anatoxine-a et de l'homoanatoxine-a. Dans ce cas, la présence de l'une ou l'autre de ces toxines dépend des conditions de croissance. Trois gènes codant le domaine kétoacylsynthase de polykétide synthases ont été identifiés chez la souche neurotoxique Oscillatoria PCC 6506. Une étude de la relation entre la production de molécules neurotoxiques et la présence de ces gènes chez quatorze souches de la PCC a montré que l'un des gènes candidat constitue un marqueur moléculaire de la neurotoxicité. Ce marqueur devrait permettre de détecter de manière précoce la présence de cyanobactérie neurotoxique sur des échantillons prélevés dans l'environnement.

- Oligopeptides bioactifs (M. Welker, S. Cadel, A.M. Castets et N. Tandeau de Marsac). Dans le cadre du projet européen PEPCY "Toxic and bioactive peptides in cyanobacteria"  (http://www.pepcy.de/), deux nouveaux groupes de gènes codant des polykétide synthases ont été caractérisés chez Microcystis PCC 7806. Ces gènes sont impliqués dans la synthèse de deux métabolites secondaires : la cyanopeptoline et l'aéruginosine. Ces deux peptides, produits par voie non ribosomale, sont des inhibiteurs de protéases à sérine. La cyanopeptoline a en outre une activité cytotoxique et promotrice de la différenciation cellulaire. Ces peptides ont été mis en évidence par HPLC et spectrométrie de masse (MALDI TOF) chez plus de la moitié des souches de Microcystis de la PCC. De nouveaux peptides et de nouveaux congénères de peptides connus, dont certains sont mono- ou di-chlorés, ont également été identifiés chez ces souches (Coll. avec H. Van Döhren, Technische Universität, Berlin, Allemagne).

2. Adaptation à l'environnement chez la cyanobactérie hépatotoxique Microcystis (P. Quillardet, A.M. Castets, D. Ciumac et N. Tandeau de Marsac)

La lumière et les nutriments interviennent dans de nombreux circuits de régulation du métabolisme et jouent un rôle essentiel dans la formation des efflorescences et la teneur intracellulaire en toxines chez les cyanobactéries planctoniques du genre Microcystis. Pour aborder une étude globale des mécanismes d'adaptation à des fluctuations des paramètres environnementaux chez ces organismes, nous avons choisi la souche hépatotoxique Microcystis aeruginosa PCC 7806. Le séquençage du génome de cette souche est en cours à la Génopole de l'Institut Pasteur (C. Bouchier et coll., Plate-forme 1 - Génomique ; L. Frangeul et coll., Plate-forme 4 – Intégration et Analyse génomique). Actuellement, nous disposons de la séquence de contigs de grande taille couvrant la quasi-totalité du génome. Des matrices d'ADN contenant une sélection de gènes ont été préparées pour des études de transcriptome en fonction de fluctuations de facteurs de l'environnement, tels que lumière et nutriments. Ces études sont en cours (Coll. avec E. Dittmann, Humboldt Universität, Berlin, Allemagne).

Le rôle des hépatotoxines, les microcystines, synthétisées par certaines souches du genre Microcystis, est inconnu. Il est cependant vraisemblable que les microcystines interviennent dans la régulation de processus importants pour la vie cellulaire. Nous avons montré en effet que la présence de ces oligopeptides influence notamment la synthèse des vésicules à gaz (flotteur intracellulaire) et celle de la RuBisCo (enzyme de fixation du CO2). La connaissance du génome a permis d'identifier, par protéomique, d'autres protéines qui répondent à la microcystine. L'une d'entre elles est un orthologue d'une protéine de plante ; d'autres sont uniques ou tout au moins absentes des autres génomes cyanobactériens séquencés. Une lectine spécifique de Microcystis a également été caractérisée. Cette lectine pourrait avoir un rôle dans l'attachement des cellules entre elles, et donc dans la formation des colonies, trait caractéristique des cyanobactéries appartenant à ce genre (Coll. avec E. Dittmann, Y. Zilliges et J.C. Kehr, Humboldt Universität, Berlin, Allemagne).

3. Génomique comparative : cyanobactéries marines et métabolisme de l'azote (N. Tandeau de Marsac)

Les cyanobactéries des genres Prochlorococcus et Synechococcus sont dominantes dans le phytoplancton marin et contribuent de façon majeure à la production primaire photosynthétique sur notre planète. Dans les régions centrales des océans pauvres en nutriments, les Prochlorococcus sont plus abondants que les Synechococcus. Inversement, ces derniers sont prépondérants dans les zones plus riches en nutriments et dans les régions côtières. En 2004, le séquençage du génome de Synechococcus WH7803, souche caractéristique des régions côtières, a été réalisé au Génoscope d'Evry (France) en collaboration avec un consortium international de cinq laboratoires (dont notre Unité) coordonné par F. Partensky, Station Biologique de Roscoff, France. La comparaison des cinq génomes de Prochlorococcus (MED4, SS120 et MIT9313) et de Synechococcus (WH8102 et WH7803) maintenant disponibles montre notamment qu'à l'exception d'un transporteur de nitrite de type protéobactérien chez MIT9313, les gènes impliqués dans le métabolisme de l'azote n'ont pas été acquis par transfert latéral mais proviennent d'une cyanobactérie ancestrale. Au cours de l'évolution, certains de ces gènes, non essentiels, ont été perdus conduisant à des génotypes spécifiques des différentes niches colonisées par les Prochlorococcus et les Synechococcus, ainsi qu'à une simplification des réseaux de régulation (Coll. avec J.M. García-Fernández, Universidad de Córdoba, Córdoba, Espagne). Cette spécialisation des génomes des cyanobactéries marines s'est accompagnée d'une réduction particulièrement importante de la taille de leurs génomes.

Légendes des photos :

Photo 1 : Arthrospira sp. PCC 9450 en culture axénique (Echelle : 20 μm).

Photo 2 : Aphanizomenon sp., Microcystis sp., Limnothrix sp. et Planktothrix sp. dans un échantillon d'eau prélevé dans lac d'eau douce en France (Echelle : 20 μm).

Mots-clés: Collection de cyanobactéries (PCC), Bases de données, Biodiversité, Toxines, Métabolisme, Génome


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