Unité: Microscopie électronique (Plate-forme)

Responsable: Marie-Christine PREVOST

Créée en 2001, la Plate-forme de Microscopie Electronique propose une activité de recherche et de développement de l'analyse ultrastructurale et morphologique en biologie cellulaire, virologie et microbiologique sur différentes thématiques en collaboration avec les chercheurs du campus. A cette activité s'ajoute une méthodologie plus spécialisée pour les localisations immunocytologiques et les cryofixations.

Une activité de service pour le contrôle de différents échantillons biologiques (cellules, cellules primaires, virus, bactéries, champignons).

Une activité d'enseignement et de formation intra muros.

La PFME (Plate-forme de Microscopie Electronique) créée par la Direction des Equipements et Technologiques Stratégiques (S. Cole) est rattachée directement au Département de Biologie Cellulaire et Infection (Ph. Sansonetti) mais est ouverte à tous. Elle a pour mission d'offrir à la communauté pasteurienne la possibilité d'effectuer des études et des travaux sur des sujets pour lesquels l'approche ultrastructurale aura un rôle essentiel dans la thématique de recherche.

Les laboratoires sont répartis sur 3 sites. La plateforme est équipée de 4 microscopes électroniques à transmission (CM10 et CM12 de chez Philips, JEM 101 et 1200EX de chez Jeol) et d'un microscope à balayage à haute résolution (JSM 6700F avec une cathode à émission froide Cold FEG de chez Jeol). Ce microscope à balayage a été installé en novembre 2002. Il nous permet d'obtenir une résolution de 2 à 3 nm à 1 Kv pour des échantillons biologiques. De même un système de cryotransfert " Gatan Alto 2500 " a été installé sur ce microscope en novembre 2004, ce qui nous permet d'observer des échantillons directement congelés ou cryofracturés. Après congélation dans de l'azote pâteux, nous procédons à une sublimation de la glace puis une métallisation avec différentes cibles (or:palladium, chrome, platine et carbone) sans passer par les fixations chimiques habituelle.

Les contrats de collaboration sont validés par un Comité de Pilotage composé de 3 personnes (Antony Pugsley, Olivier Schwartz et Jean-Pierre Bourgeois).

La plate-forme propose également, avec l'accord du Directeur des plates-formes technologiques et du Comité de Pilotage, de développer de nouvelles technologies et méthodologies dans des domaines plus pointus de l'analyse ultrastructurale telles que les cryotechniques liées à la biologie cellulaire et d'assurer ainsi une veille technologique.

Depuis la création de la Plate-forme de Microscopie Electronique, nous avons engagé des collaborations avec différentes unités du campus sur des thèmes divers (90 contrats de collaboration). Ces thèmes ont nécessité une approche en microscopie électronique aussi bien sur des techniques classiques que sur des techniques plus spécialisées telles que les immunomarquarges à l'or colloïdal avec différentes approches (cryocoupes, cryofixation et cryosubstitution).

En 2004, nous avons initié 26 contrats de collaboration.

Voici quelques exemples de projets :

Biologie Cellulaire et Infection

Etude de la surface de Shigella flexneri.

Etude sur la visualisation directe et indirecte des chaînes latérales polyosidiques du LPS à la surface de Shigella flexneri afin d'identifier le phénotype de mutations affectant la structure et la composition de cette fraction polyosidique.

Collaboration avec Joëlle Mounier et Philippe Sansonetti ,Unité de Pathogénie Microbienne et Moléculaire.

Virologie

Etude sur le VIH

Etude des voies d'entrée du VIH dans des cellules primaires (lymphocytes, macrophages et cellules dendritiques) et rôle de l'entrée par endocytose, phatocytose et macropynocytose. Pour cette étude, nous avons utilisé la microscopie ultrastructurale l'immunomicroscopie et la microscopie électronique à balayage à haute résolution.

Collaboration avec le groupe d'Olivier Schwartz, Groupe à 5 ans Virus et Immunité

Etude sur le VHC

Etude sur la possibilité d'assembler en pseudo-particules virales chimères (VLPs) des protéines de capside et d'enveloppes hétérologues dérivées du virus de l'hépatite C et du virus GBV-B (un flavivirus non classé) : examen par coloration négative et immunomarquage avec des anticorps anti-enveloppe de préparations de VLPs purifiées à partir de cellules d'insectes infectées par des baculovirus recombinants qui expriment les précurseurs structuraux chimères.

Collaboration avec le groupe d'Annette Martin, Unité de Génétique Moloculaire des Virus Respiratoires.

Médecine moléculaire

Etude sur le VIH

Analyse structurale et localisation cellulaire du complexe de pré-intégration HIV muté ou non dans le DNA flap. Nous avons visualisé par microscopie électronique et immunogld des structures juste à l'extérieur des pores nucléaires. Nous venons de visualiser la surface de noyaux purifiés avec la microscopie électronique à balayage à haute résolution qui nous permettra de faire une analyse immunologique quantitative.

Collaboration avec le groupe de Pierre Charneau, Groupe à 5 ans de Virologie Moléculaire et de Vectorologie.

Pathogenèse microbienne

Etude sur les mycobactéries

Localisation par immunomarquage de protéines " Sérine-Thréonine-Protéine-Kinases B, D, E et F " ches Mycobacterium tuberculosis qui sont des protéines régulatrices de nombreux processus métaboliques (développement cellulaire, réponse au stress, interactions avec les cellules hôtes) et présumées impliquées dans la pathogénicité.

Collaboration avec le groupe de Stewart Cole, Unité de Génétique Moléculaire Bactérienne.

Activités de Service

La Plate-forme de Microscopie Electronique contrôle différents échantillons biologiques (virus, lignées cellulaires primaires et continues, bactéries et champignons). Ces analyses sont faites pour les unités du campus qui ont besoins de ces contrôles pour poursuivre leurs investigations de recherche.

Activités d'enseignement

Les différentes techniques de microscopie électronique sont enseignées aux chercheurs, enseignants et techniciens des laboratoires qui souhaitent utiliser ces technologies de façon autonome.

Légendes

Photo 1 : Pore nucléaire provenant de cellules Hela après congélation en microscopie électronique à balayage "Jeol 6700F" avec le système de cryotransfert Gatan "Alto 2500" : N Arhel, S. Guadagnini, P. Charneau, M-C Prévost

Mots-clés: Microscopie Electronique, Ultrastructure, Immunomarquage, cryocoupes, cryofixation


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