Unité: Neuro-immunologie Virale

Responsable: Monique Lafon

Le thème de recherche de l'UP consiste à étudier comment certains virus neurotropes favorisent la survie des neurones et paralysent la réponse immunitaire. L'étude des bases moléculaires des mécanismes mis en jeu et l'identification de facteurs viraux neuroprotecteurs devraient permettre de développer des stratégies thérapeutiques neuroprotectrices.

La plupart des infections virales induisent la destruction des cellules infectées et sont éliminées par le système immunitaire. Cependant, certains virus ont élaboré des stratégies qui leur permettent d'échapper à la réponse de l'hôte. Le virus de la rage est un virus neurotrope extrêmement pathogène. Il induit une encéphalomyélite d'issue toujours fatale. Après son inoculation par morsure au niveau d'un muscle, le virus de la rage entre dans le système nerveux (SN) où il se propage en infectant exclusivement les neurones avant d'être excrété au niveau des glandes salivaires et pouvoir contaminer un nouvel hôte. Paradoxalement, malgré sa forte pathogénicité, le virus de la rage n'induit pas la mort des neurones et la réponse immunitaire qu'il génère ne parvient pas à entraver sa progression au travers du SN. La préservation de l'intégrité des neurones qu'il infecte et l'échappement à la réponse immune assurent avec succès son cheminement au travers du SN et sa transmission à un nouvel hôte. Le virus de l'Herpes Simplex de type 1 (HSV-1) est un virus neurotrope qui après une phase d'infection aiguë des neurones sensoriels entre en état de latence sous la pression du système immunitaire. Il n'échappe donc pas entièrement à la réponse immune, mais peut, sous certaines conditions, sortir de son état de latence (bouton de fièvre) et infecter un nouvel individu. Il peut aussi infecter le SN et induire une encéphalite sévère. Le virus West Nile est transmis à l'Homme par les piqûres de moustiques eux-mêmes contaminés au contact d'oiseaux migrateurs. Il induit une infection pulmonaire, qui est généralement éliminée par la réponse immunitaire de l'hôte, grâce surtout aux anticorps et aux lymphocytes CD8+. Occasionnellement, le virus peut gagner le SN chez les personnes âgées ou immunologiquement déprimées et provoquer une méningo-encéphalite souvent mortelle qui s'accompagne de la destruction des neurones par apoptose. Ce virus ne parvient à échapper aux défenses immunitaires de l'hôte que lorsqu'elles sont affaiblies (ex :système immunitaire des personnes âgées). Ces trois virus sont utilisés comme trois modèles d'infections virales du SN plus ou moins performantes dans leur aptitude à manipuler la survie des neurones et la réponse immune de l'hôte.

A- Les modèles viraux et cellulaires

La pathologie du virus de la rage et celle du virus West Nile pour le SN est étudiée dans des modèles d'infection du SN de la souris que nous avons mis au point pour ces deux virus. Les études sur HSV-1 sont exclusivement réalisées in vitro. Nous disposons de souches de virus de rage de pathogénicité différente. Nous utilisons en particulier des souches de virus de rage qui induisent la survie des neurones ou au contraire leur destruction par apoptose et des souches qui induisent soit une encéphalomyélite aiguë mortelle soit une infection du SN transitoire et non fatale.

Les analyses in vitro sont réalisées à la fois sur des cultures de neuroblastomes humains SK-N-SH, des cultures de neuroblastomes humains différenciés par un traitement à l'acide rétinoïque, SK-N-SH/RA (Wainwright, 2001),et sur des cultures de neurones humains post-mitotiques (NT2-N) ou des co-cultures de neurones et d'astrocytes humains (NT2-N/A) (PHOTO1). Les NT2-N et les NT2-N/A sont différenciées à partir du clone 2D1 de tératocarcinome humain NTera-2 (Pleasure, 1992) en présence de traitement séquentiel à l'acide rétinoïque, d'inhibiteur de mitoses et grâce à l'utilisation de substrats adaptés (Cheung et al, 1999). Des variations du protocole de différenciation permettent d'obtenir soit des cultures pures de neurones (NT2-N) soit des cultures mixtes neurones /astrocytes (NT2-N/A) (Sandhu et al, 2002). (Christophe Prehaud et Mireille Lafage)

B- Analyse des transcriptomes de neurones humains infectés par le virus de la rage et HSV-1

Une recherche exhaustive des gènes cellulaires que les neurones humains sur expriment lorsqu'ils sont infectés par le virus de la rage ou HSV-1 a été réalisée à l'aide de micro-arrays. L'analyse intégrative et comparative des transcriptomes de neurones humains post-mitotiques (NT2-N) non infectés ou infectés par le virus de la rage a été réalisée à l'aide des biopuces Affymetrix humaines U133A et U133B. Comparées aux cultures de NT2-N non infectées, les cultures infectées par le virus de la rage présentent essentiellement une sur expression de gènes de l'immunité innée et en particulier une robuste réponse IFN-β. Les neurones humains NT2-N infectés par le virus de la rage produisent la protéine CXCL-10 (PHOTO 2). De l'IFN-β  est détectable dans le surnageant des cultures neuronales infectées. A la différence du virus de la rage la réponse des neurones humains à l'infection par le virus HSV-1 ne recrute pas parmi les gènes de l'immunité innée.

A la différence des neurones, les astrocytes sont peu sensibles à l'infection rabique, néanmoins les astrocytes établissent des contacts étroits avec les neurones. L'impact de l'infection des neurones sur le transcriptome des astrocytes est étudié en comparant les transcriptomes des cultures mixtes neurones/astrocytes humains infectées (NT-2N/A) aux transcriptomes des cultures de neurones pures infectées par le virus de la rage (Christophe Préhaud, Françoise Mégret, Mireille Lafage, Monique Lafon en collaboration avec la Génopole de l'Université Louis Pasteur de Strasbourg et Lars Rogge de l'Institut Pasteur).

C- Virus de la rage et neuroprotection

Les souches de virus de la rage pathogènes sont neuroprotectrices. Ce paradoxe est observé aussi bien in vitro avec différents types de cellules qu'in vivo (Baloul L et Lafon M, 2003, Lay S et al, 2003, Prehaud C 2003, Thoulouze M-I et al, 1997, 2003). La surexpression de Bcl-2 au cours de l'infection joue un rôle dans ce processus aussi bien in vitro dans des cultures de cellules humaines, (Thoulouze M-I et al, 2003) qu'in vivo au cours de l'infection du SN de la souris (Baloul L and Lafon M, soumis) PHOTO 3. Cependant la surexpression de Bcl-2 n'intervenant que tardivement dans le cours de l'infection, nous avons cherché à identifier les gènes qui pourraient infléchir précocement le devenir du neurone infecté. La recherche des gènes impliqués dans la survie neuronale a été réalisée en comparant les transcriptomes de neurones humains NT2-N infectés avec une souche de virus de la rage neuroprotectrice aux transcriptomes des NT2-N infectées avec une souche de virus non neuroprotectrice.

L'analyse intégrative et comparative des transcriptomes de neurones humains post-mitotiques (NT2-N) induits par l'infection des deux souches virales différentes a été réalisée à l'aide des biopuces Affymetrix humaines U133A et U133B. Cette étude a permis d'identifier au moins deux gènes cellulaires qui seraient impliqués dans la survie des neurones. La surexpression de ces deux gènes dans les NT2-N par l'infection rabique a été vérifiée par PCR en temps réel. Le rôle qu'ils pourraient jouer dans la neuroprotection est en cours d'étude (Christophe Préhaud, Françoise Mégret, en collaboration avec la Génopole de l'Université Louis Pasteur de Strasbourg et Lars Rogge de l'Institut Pasteur).

Les bases moléculaires de la survie neuronale suite à une infection rabique sont aussi recherchées au niveau des voies d'activation stimulées par l'infection. Plusieurs voies d'activation, comme celles faisant intervenir la phosphatidylinositol-3-OH-kinase (PI3K)-AKT, ou ERK (extracellular signal-regulated kinase) contribuent à la survie neuronale (Brunet A et al, 2001, Hetman et Gozdz, 2004). Nous testons actuellement l'hypothèse selon laquelle les souches de virus neuroprotecteurs activeraient au moins l'une de ces voies ou inhiberaient l'une des voies impliquées dans l'apoptose telles que les SAPK (stress-activated protein kinases: p38 MAPK et JNK). (Michèle Roa et Monique Lafon).

D- Immunosubversion et infection du SN par des virus neuronotropes

Fas-L et infection par le virus de la rage

Nous avions déjà observé que le virus de la rage induisait une paralysie de la réponse immune au niveau des organes lymphoïdes en périphérie (Camelo S et al, 2001). Nous venons d'établir que le virus de la rage était aussi capable de déjouer les défenses immunitaires de l'hôte dans le SN en détruisant les lymphocytes T qui y migrent au cours de l'infection. La destruction des lymphocytes T migrants résulte de la sur expression dans le SN du ligand de la molécule Fas, le Fas-L, au cours de l'infection par le virus de la rage. Les molécules de Fas-L exprimées par les neurones du SN infecté se lient aux lymphocytes en y induisant un signal de mort et leur élimination par apoptose. L'absence de Fas-L diminue la sévérité de l'infection rabique (Lafon, 2004, Baloul et al, 2004). La sur expression de Fas-L joue un rôle important dans la survie des neurones infectés puisqu'elle leur confère une protection contre la réponse immune cellulaire qui tendrait à les éliminer. Les données expérimentales laissent penser que Fas-L ne serait pas la seule molécule immunosubversive manipulée par le virus.

Nous avons recherché si le virus de la rage ne pouvait pas aussi moduler l'expression d'autres molécules immunosubversives comme les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I non classiques, HLA-G, E, F ou les molécules inhibitrices de stimulation, les " B and T lymphocyte attenuators " (BTLA).

HLA-G et infection par le virus de la rage et HSV-1

La molécule HLA-G joue un rôle dans l'établissement de la tolérance en protégeant les cellules cibles, comme les cellules tumorales ou cellules fœtales semi-allogéniques de l'attaque des cellules NK ou de l'attaque des cellules cytotoxiques CD8 (Carosella E, et al, 2000). La sur expression de la molécule HLA-G au niveau transcriptionnel et protéique au cours de l'infection par le virus de la rage a été mise en évidence in vitro dans un modèle de cultures de neurones post-mitotiques humains NT2-N, et dans des cultures de SK-N-SH/RA. Le virus de la rage stimule l'expression de HLA-G aussi bien dans les cellules infectées (effet cis) que dans les cellules non infectées (effet trans), en particulier dans les astrocytes des cultures mixtes neurones/astrocytes (NT2-N/A). Ceci suggère que la molécule HLA-G puisse participer à l'établissement d'un environnement hostile aux lymphocytes et natural killer cells (NK) au cours de l'infection du SN. HSV-1 induit aussi la sur expression de HLA-G. (Monique Lafon, Françoise Mégret, Christophe Préhaud, Mireille Lafage, Michèle Roa en collaboration avec Nathalie Rouas-Freiss et Philippe Moreau de l'Unité d'Immuno-Hématologie CEA/Hôpital Saint-Louis, dirigée par le Pr Edgardo Carosella.)

BTLA et infection par le virus de la rage

Les BTLAs sont des récepteurs membranaires immunosuppresseurs. Les BTLAs ont la propriété d'inhiber la prolifération des cellules B et T et réduire leur aptitude à produire des cytokines. Les BTLAs participeraient au contrôle des réponses immunes, leur dérégulation a été observée dans les tumeurs et au cours d'atteintes auto-immunes du SN (Wiendl H et al. 2005). Nous avons mis en évidence que le virus de la rage favorisait l'expression de certains BTLAs dans des cultures de neurones humains post-mitotiques mais aussi in vivo par les neurones infectés au cours de l'infection du SN de la souris. Nous proposons que leur expression au cours de l'infection rabique participe, comme Fas-L et HLA-G, à la stratégie d'immuno-évasion du virus de la rage. L'infection des neurones par HSV-1 ne fait pas sur exprimer de BTLA (Monique Lafon, Mireille Lafage, Myriam Lucia Velandia,, Françoise Mégret, Christophe Préhaud, en collaboration avec le Pr Heinz Wiendl, Université de Würzburg, Allemagne)

Virus du West Nile et cellules NK

Le virus West Nile (WN), un arbovirus du genre des flavivirus, est l'agent étiologique de la fièvre West Nile dont la manifestation la plus sévère est une méningo-encéphalite souvent fatale chez les sujets âgés. Le rôle de la réponse immune innée, et en particulier celui des cellules NK, diminue chez les sujets âgés. Nous avons entrepris de définir quel rôle la réponse innée et en particulier les NK jouaient dans le contrôle de l'infection du SN par le virus West Nile. (Thérèse Couderc, Anne-Claire Brehin, Monique Lafon, en collaboration avec Philippe Despres de l'Institut Pasteur)

E- Inflammation et neuroprotection

L'inflammation du SN au cours d'une infection ou d'un traumatisme peut être un facteur aggravant ou au contraire bénéfique. Les conditions qui rendent l'inflammation neuroprotectrice ou destructrice ne sont pas bien connues. Au cours de la propagation du virus de la rage dans le SN, de nombreuses cytokines et chimiokines sont produites dans le parenchyme neural dont certaines très précocement. Il s'agit de cytokines comme le TNF-α, l'IL-1β ou l'IL-6 et de chimiokines comme MCP-1ou CXCL10. On observe aussi l'expression de récepteurs aux chimiokines comme CCR1, 2 , 5, 8 et CXCR3 (Lafon M 2004, Baloul et Lafon, 2004, Baloul L et al,, 2004, Camelo S et al, 2001). Nous avons établi que le virus de la rage déclenchait au niveau du SN une forte réponse immune innée aussi bien in vitro, ( forte réponse IFN-β en particulier dans les neurones) qu'in vivo. Néanmoins, il est surprenant de constater le peu d'efficacité de cette réponse sur l'infection rabique. En effet, ni le complément, ni l'IFN-β ne s'opposent significativement à la propagation du virus (Hooper G et al, 1998). Il semblerait même que le virus pourrait tirer avantage de l'inflammation qu'il provoque. Nous avons en effet montré in vivo, en comparant la pathologie rabique de souris invalidées pour le récepteur de type 1 au TNF-α (P55TNFR) que l'absence de ce type de récepteur au TNF-α retardait la propagation du virus dans le SN (Camelo S et al, 2001). Ceci suggère que paradoxalement, l'inflammation dans certaines conditions puisse assurer la neuroprotection. Les mécanismes qui soutendent cette association sont en cours d'étude (Monique Lafon).

PHOTO 1 (contribution C Prehaud) Co-cultures neurones/astrocytes humains NT2-N/A

PHOTO 2 (contribution M Lafage) des neurones humains NT2-N infectés par le virus de la rage expriment CXCL-10. Les neurones humains post-mitotiques expriment CXCL-10 (vert) après infection par le virus de la rage. Les noyaux des cellules sont colorés en bleu (Hoechst)

PHOTO 3 (contribution L Baloul) Les neurones du SN de souris infectées par le virus de la rage expriment Bcl-2 (orange). Les noyaux des cellules sont colorés en bleu (Hoechst). Certains sont fragmentés, ils correspondent aux noyaux de lymphocytes T migrant en apoptose.

Mots-clés: neurone, rage, HSV-1, NT2-N, HLA-G, BTLA, virus West Nile, biopuces, Virologie, Immunologie, Neurologie


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