Unité: Mycologie Moléculaire

Responsable: DROMER Françoise

Une meilleure connaissance de l'interaction entre l'hôte et les champignons pathogènes pourrait améliorer le pronostic des mycoses systémiques. Nous centrons nos recherches sur la pathogénicité de Cryptococcus neoformans et de Candida albicans par une approche simultanée de l'hôte (études cliniques et épidémiologiques, modèles animaux) et du pathogène (facteurs de virulence, variabilité).

Cryptococcus neoformans

C. neoformans est une levure basidiomycète capsulée qui provoque des méningo-encéphalites de pronostic sévère malgré les traitements antifongiques, avec une mortalité précoce de l'ordre de 20%. Ceci justifie la recherche de mesures thérapeutiques ou prophylactiques nouvelles. Cette infection opportuniste touche jusqu'à 30% des patients infectés par le virus de l'immunodéficience humaine dans certains pays d'Afrique et d'Asie du Sud Est. L'étude de la physiopathologie des cryptococcoses et des mécanismes de virulence de Cryptococcus neoformans représente à terme les meilleurs moyens d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cryptococcose.

Etude de la capsule de C. neoformans (G. Janbon, F. Moyrand)

Chaque cellule de C. neoformans est entourée d'une capsule polysaccharidique qui représente le facteur de virulence principal. Ainsi, les souches acapsulées sont avirulentes et la capsule a un effet délétère sur la réponse immunitaire. L'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques nous a permis d'observer une grande variabilité de structure d'une cellule à l'autre au sein d'une même population cellulaire. Notre hypothèse de travail est que la variabilité de la structure de la capsule est, au moins pour une part, responsable de la virulence de C. neoformans. Nous avons cloné des gènes codant pour divers éléments de la voie de biosynthèse du polysaccharide capsulaire. Un programme de disruption systématique des gènes potentiellement impliqués dans la synthèse des polysaccharides capsulaires est en cours et nous avons d'ores et déjà construit prés de 60 souches mutantes. Ces souches sont non seulement utilisées pour étudier l'influence de la structure de la capsule sur la physiopathologie de la cryptococcose mais aussi, pour l'étude plus fondamentale des voies de biosynthèse des polysaccharides chez les eucaryotes (régulation du transport de nucléotides-sucres dans l'appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique, influence de l'épissage de certains gènes sur la structure de la capsule…). En effet, C. neoformans peut être considéré à de nombreux égards comme un très bon modèle pour l'étude de la biosynthèse des polysaccharides chez les eucaryotes supérieurs.

Etude du franchissement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par C. neoformans (C. Charlier, E. Mordelet, S. Daou, F. Dromer)

Les mécanismes de franchissement de la BHE par C. neoformans sont encore inconnus. La cinétique de franchissement de la BHE et de la dissémination du pathogène est étudiée dans le modèle de cryptococcose disséminée de la souris non congénique grâce à des techniques classiques d'évaluation de la charge fongique, d'histologie et d'immunohistochimie en collaboration avec Fabrice Chrétien (INSERM EMI 0011, Hôpital H. Mondor, Créteil). Nous avons pu établir que le franchissement de la barrière hémato-encéphalique survenait dès la 6ème heure après l'inoculation intraveineuse, dans les capillaires corticaux et non dans les plexus choroïdes. Le franchissement des endothéliums au cours de la dissémination s'accompagnent, en fonction des organes, d'une modification de la taille des levures et de leur structure capsulaire plus ou moins rapide. Des modèles cellulaires sont actuellement mis au point au laboratoire pour étudier plus précisément les interactions entre C. neoformans et les cellules endothéliales d'une part, et les monocytes d'autre part (figure 1).

Candida albicans

Candida albicans, une levure ascomycète saprophyte du tube digestif, est le deuxième microorganisme étudié dans l'Unité de Mycologie Moléculaire. Cette levure est responsable d'infections sévères chez des patients immunodéprimés par des chimiothérapies aplasiantes, des transplantations d'organes ou de moelle osseuse, mais aussi d'infections nosocomiales dans des services de réanimation.

Etude de la biosynthèse des β1,2 oligo mannosides chez C. albicans (G. Janbon, C. Mille)

Le contact entre C. albicans et les cellules de l'hôte se fait au niveau de la paroi du champignon. Celle-ci est principalement composée de glucanes (polymères β-1,3 et β-1,6 de résidus glucose), de mannanes (polymères α-1,2 et α-1,3 de résidus mannose) et de mannoprotéines. En plus de ces polymères α de résidus mannose, des β-1,2 oligomannosides sont associés soit aux mannoprotéines pariétales soit au phospholipomannane (PLM). De nombreuses études ont montré que la présence de ces résidus était associée à la virulence de C. albicans. Alors que les voies de biosynthèse des β-glucanes et les mannoprotéines sont au moins partiellement connues, aucun gène participant à la synthèse des β-1,2 oligomannosides n'a été identifié que ce soit au niveau du PLM ou de la paroi. En étroite collaboration avec le laboratoire de D. Poulain à Lille, nous avons identifié des gènes nécessaires à la synthèse des β-1,2 oligomannosides chez C. albicans, C. glabrata et S. cerevisiae en vue de déterminer l'influence de ces résidus sur la physiopathologie des infections.

Etude de la formation de biofilms chez C. albicans et C. glabrata (G. Janbon, F. Dromer, I. Iraqui)

Les biofilms sont des structures tri-dimensionnelles de micro-organismes qui se développent sur différents supports. En ce qui concerne les Candida, ces structures peuvent se développer sur les cathéters ou encore sur des prothèses et sont certainement des sources de recidives après un traitement antifongique. L'objectif de ce projet est de déterminer les mécanismes moléculaires de la formation de biofilms à Candida. Ce projet fait l'objet d'un PTR avec les groupes de C. D'Enfert (Unité Postulante Biologie et Pathogénicité fongiques) et de JM Ghigo (Groupe à 5 ans, Génétique des Biofilms).

Nous avons aussi cherché à identifier des gènes nécessaires à la formation des biofilms. Pour cela, nous avons utilisé Candida glabrata comme modèle. C. glabrata a en effet l'avantage non seulement d'être une levure pathogène deuxième en terme d'importance après C. albicans mais aussi d'être un microorganisme haploïde ce qui permet de faire un peu de génétique. Ismail Iraqui (post-doctorant), en charge de ce projet a criblé une collection de mutants d'insertion pour leur capacité à former des biofilms dans un modèle de biofilm en plaques 96 puits. Il a ainsi identifié plus de 100 souches mutantes qui étaient, soit incapables de faire des biofilms (phénotype Biofilm-), soit qui formaient plus de biofilm que la souche originale (phénotype Biofilm++) (figure 2). L'analyse de quelques sites d'insertion lui a permis d'identifier une adhésine essentielle pour la formation des biofilms et de comprendre sa régulation. Nous avons pu en effet démontrer que le niveau de transcription cette adhésine était régulé par le silencing télomérique, par un signal activé en condition de croissance biofilm et par la kinase Yak1p. Confirmant l'intérêt d'utiliser C. glabrata comme modèle, la kinase Yak1p est apparue nécessaire à la formation de biofilm par C. albicans.

Centre National de Référence Mycologie et Antifongiques (F. Dromer, O. Lortholary).

Les nouvelles missions du CNRMA sont très variées. Elles impliquent d'une part, une expertise dans le domaine de l'identification des levures et des champignons filamenteux pathogènes (D. Garcia-Hermoso, J.-C. Gantier, D. Raoux, D. Hoinard, O. Ronin), leur typage moléculaire (S. Bretagne, D. Garcia-Hermoso), et les tests de sensibilité aux antifongiques, ainsi que dans la prise en charge des patients suspects ou atteints de mycoses sévères par le biais de conseils, et d'autre part, la surveillance épidémiologique des mycoses sévères, rares ou exotiques, et de la résistance aux antifongiques. Une surveillance active (l'Observatoire des Levures) a été mise en place pour surveiller ces infections en région parisienne et caractériser, au cours du temps, les espèces de levures responsables de fongémies (identification, typage, profil de sensibilité). Le serveur RESOMYC de déclaration en ligne sera accessible en 2005 aux personnels de santé cliniciens et microbiologistes/mycologues impliqués dans la prise en charge des patients atteints de mycoses invasives.

http://www.pasteur.fr/sante/clre/cadrecnr/mycoses/mycoses-pratique.html

Etude du syndrome de reconstitution immunitaire au cours des mycoses invasives chez les patients infectés par le VIH (O. Lortholary, F. Dromer).

La survenue d'un syndromes inflammatoires de reconstitution immunitaire (IRIS) au cours de la cryptococcose compliquant une infection par le VIH a été signalée. Le syndrome se caractérise par des symptômes aigus compatibles avec un processus inflammatoire survenant dans un contexte de cultures fongiques négatives et d'une réponse immunologique et ou virologique aux antirétroviraux hautement actifs Grâce à la surveillance épidémiologique de la cryptococcose en France mise en place au CNR Mycologie et Antifongiques et à la constitution d'une cohorte de patients infectés par le VIH et ayant eu un premier épisode de cryptococcose survenu entre mars 1996 et juin 2000 (Etude CryptoStop), nous avons pu calculer l'incidence, étudier les facteurs de risque de survenue d'un IRIS au cours de l'infection à C. neoformans et mieux préciser les caractéristiques de cette entité émergente en collaboration avec l'Unité d'Epidémiologie des Maladies Emergentes (A Fontanet). La survenue de cas liés à un IRIS succédant au diagnostic d'histoplasmose a également pu être décrite grâce aux réseau de cliniciens et mycologues correspondant du CNR Mycologie et Antifongiques. Dans les deux as, la survenue de l'IRIS est associé à la prescription d'anti-rétroviraux hautement actifs précocement après le diagnostic d'une mycose systémique disséminée. Ces données impliquent une particulière vigilance des cliniciens dans ce contexte.

Etude de l'efficacité des associations d'antifongiques in vivo (E. Dannaoui, P. Schwarz, O. Lortholary, F. Dromer)

Des modèles animaux ont été utilisés pour tester in vivo l'activité d'associations d'antifongiques sur Aspergillus fumigatus et C. neoformans. Les antifongiques testés étaient l'amphotéricine B, la 5-fluorocytosine, la caspofungine, et l'itraconazole. Différents modèles expérimentaux de cryptococcose et d'aspergillose disséminée ont été utilisés chez la souris pour évaluer l'efficacité des associations d'antifongiques. Les paramètres qui ont permis de comparer l'effet des associations par rapport aux monothérapies étaient soit le taux de mortalité des animaux soit la charge fongique dans les organes cibles de l'infection. Dans le cadre de la cryptococcose ces études ont permis en particulier de comparer l'intérêt des associations pour des souches de C. neoformans sensibles ou résistantes à certains antifongiques. Dans le modèle de l'aspergillose les résultats ont permis de confirmer certains résultats antérieurs obtenus in vitro et de démontrer l'intérêt potentiel d'associations d'antifongiques encore inexploitées.

Identification moléculaire des champignons filamenteux (M. Desnos, E. Dannaoui, D. Garcia-Hermoso, S. Bretagne, Jean-Charles Gantier, F. Dromer)

L'identification des champignons filamenteux repose actuellement sur les caractères culturaux macroscopiques et sur la morphologie observée en microscopie. Pour un certain nombre de groupes de champignons ces caractéristiques ne sont pas discriminantes pour une identification au niveau de l'espèce ou n'apparaissent que difficilement et tardivement après plusieurs semaines de culture. Les agents fongiques responsables des mycétomes a grains noirs font partie de ces champignons d'identification difficile. Pour ces raisons nous avons entrepris d'évaluer l'intérêt potentiel de l'identification moléculaire pour ce groupe de champignons. Une grande série de souches responsables de mycétomes a ainsi été caractérisée par séquençage de l'ADN ribosomal (région ITS1-5.8S-ITS2). Cette approche moléculaire permettait une identification rapide au niveau de l'espèce. Ce travail a également permis d'obtenir des données originales pour un certain nombre d'espèces qui n'avaient jamais été caractérisées sur le plan moléculaire.

Légendes des photos :

Figure 1 : monocytes murins ayant phagocytés des levures préalablement marquées à la fluoresceïne (C. neoformans souche H99). A gauche, photographie au microscope à contraste interférentiel, à droite microscope à épifluorescence (grossissement x 1000).

Figure 2: Biofilm de Candida glabrata (mutant biofilm++) sur une surface de plastique (Microscopie à balayage).

Mots-clés: Cryptococcus neoformans, capsule, polysaccharide, mycologie, physiopathologie, antifongiques, Candida albicans, Candida glabrata, Aspergillus sp., biofilms, barrière hémato-encéphalique


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