Unité: Immunophysiologie et Parasitisme Intracellulaire

Responsable: MILON Geneviève

Dans notre Unité sont analysés et caractérisés, à l'échelle tissulaire, cellulaire, subcellulaire et moléculaire, des processus qui rendent compte des interactions renouvelées et durables que des parasites eucaryotes, les leishmanies, établissent chez l'un des deux organismes hôtes (l'hôte mammifère) dont dépend leur pérennité. Pour faciliter la caractérisation de ces processus in vivo/ex vivo, des études sont également réalisées in vitro avec des leucocytes phagocytaires professionnels de souris : ces leucocytes sont en effet détournés soit comme cellules hôtes par les promastigotes métacycliques et leur descendance, les amastigotes, soit comme cellules navettes auquel cas, ils transportent des amastigotes du tissu où leurs progéniteurs ont été inoculés vers des tissus distants du site d'inoculation.

Les leishmanies, objets de nos études, sont des parasites protozoaires, dont la pérennité dépend de deux autres organismes vivants (1) le phlébotome femelle adulte et (2) un mammifère, qui est aussi détourné comme source de sang par les femelles phlébotomes. Chez l'insecte, le développement des parasites a lieu dans le tube digestif ; au sein de cette niche tissulaire, les leishmanies sont extracellulaires et sont désignées par le terme "promastigotes" ; au terme d'un cycle de prolifération au cours duquel elles sont attachées à la membrane apicale des cellules épithéliales du tube digestif, elles se détachent et se différencient en promastigotes métacycliques, les seuls stades de développement qui s'établissent chez l'hôte mammifère. Nous analysons et caractérisons les interactions dynamiques et durables que les métacycliques et leur descendance établissent chez des souris de laboratoire, hôtes chez lesquels ils détournent des phagocytes professionnels comme cellules hôtes ou comme cellules navettes. En outre est criblée la validité de nouveaux modèles pour appréhender un processus trop négligé bien qu'essentiel à la pérennité des parasites, celui de la transmission des leishmanies de l'hôte mammifère à l'hôte vecteur, le phlébotome insecte dont la pérennité est elle-même dépendante du sang prélevé chez des mammifères hôtes des leishmanies. Toutes ces explorations traduisent notre volonté d'identifier les traits de vie des leishmanies ; elles révèlent aussi que les parasites sont de remarquables sondes pour appréhender des propriétés de remodelage des tissus et les bases de leur détournement comme niches où ces parasites se développent et/ou persistent.

Des promastigotes métacycliques de Leishmania spp. et leur descendance - les amastigotes - s'établissent "silencieusement " dans des leucocytes dendritiques de souris [J.-C. Antoine, E.Prina, projet facilité par G. Milon ; partiellement en collaboration avec Nathalie Winter (Unité de Génétique mycobactérienne)].

Une espèce de Leishmania, L. amazonensis a été sélectionnée dans la mesure où l'obtention, in vitro, du stade de développement, promastigotes métacycliques, est relativement aisée. Ont d'abord été caractérisées les propriétés des vacuoles parasitophores (VP) de leucocytes dendritiques. Il a été possible d'établir que les VP, où s'établissent, se différencient, les promastigotes métacycliques de L.amazonensis sont des compartiments subcellulaires très dynamiques. En outre le processus d'entrée puis le développement des leishmanies dans ces leucocytes dendritiques sont des processus silencieux. Outre une analyse des transcrits de cytokines, de chimiokines, de leurs récepteurs, ont été criblées les molécules de membrane qui confèrent ou non aux LD leurs propriétés à " activer " des lymphocytes T ou qui leur confèrent les fonctions de navettes transportant les parasites vers des tissus distants du site où elles ont été phagocytées par ces LD. Soulignons que le terme " activer " peut référer aussi bien à la programmation de lymphocytes régulateurs – contre-inflammatoires – qu'à celle de lymphocytes pro-inflammatoires. Pour ces explorations, ont été définies et validées des méthodes d'analyse quantitative (PCR quantitative en temps réel, détection simultanée de plusieurs analytes avec l'équipement Luminex Bioplex et les trousses Biorad pour le moment).

Le parasitisme à l'échelle tissulaire et l'imagerie en temps réel in vivo ou ex vivo : (T. Lang, M. Lebastard 6 31/03/04, H. Lecoeur depuis le 1/11/04, G. Milon) - collaboration avec la Plate-Forme d'Imagerie Dynamique ( M.-A. Nicola, E. Perret, P. Roux, S. Shorte) avec le Pôle de Recherche Clinique (G. Morizot, P. Buffet).

Pour tenter de caractériser les processus " discrets " via lesquels les leishmanies s'établissent et persistent, in vivo, dans le derme de leurs hôtes mammifères, nous avons tenu compte de propriétés de l'écosystème naturel au sein duquel circulent les leishmanies. Chez leurs hôtes et vecteurs, les phlébotomes, après une phase d'expansion de la population des promastigotes au contact des cellules épithéliales de l'intestin moyen, il y arrêt des processus de division cellulaire et différenciation en promastigotes métacycliques qui, soit persistent dans un gel au niveau de la lumière de l'intestin moyen, soit atteignent la partie antérieure du tube digestif. Quel que soit le site à partir duquel sont régurgités ces promastigotes métacycliques, le nombre déposé dans le derme superficiel de l'hôte, source de sang, est estimé entre 10 et 1.000/sondage/repas sanguin. Aussi, inoculons nous un faible nombre (100, 1000 maximum 10.000) de métacycliques, soit de L. amazonensis, soit de L. major dans le derme de l'oreille de souris C57Bl/6 ou BALB/c. Plusieurs processus sont analysés : outre l'absence, la présence de signes cliniques, leur guérison ou non au site d'inoculation, sont estimées les charges parasitaires, d'une part dans le site d'inoculation, mais aussi dans le ganglion lymphatique drainant, et des tissus cutanés distants glabres ou non (oreille contralatérale, queue, peau scapulaire…). Il importe de noter que la lésion cutanée transitoire au site d'inoculation de L. major chez C57Bl/6, traduit une séquence d'événements discrets que nous pouvons décrire qualitativement et quantitativement comme suit : au niveau de l'oreille inoculée (a) une phase de différenciation promastigotes en amastigotes, (b) une phase d'expansion de la population des amastigotes au sein de leucocytes phagocytaires mononucléés, dont l'origine locale ou non et les propriétés vont enfin pouvoir être étudiées grâce à l'acquisition du cytomètre analyseur trieur FACSARIA et la disponibilité de souris transgéniques, puis (c) une réduction de la charge parasitaire. Cette phase de réduction de la charge parasitaire est couplée à un recrutement de leucocytes non T non B (monocytes, neutrophiles, éosinophiles, des leucocytes dendritiques). Ce recrutement tardif est initié par l'extravasation, dans le derme, de lymphocytes T CD4 et CD8.Il semble que le recrutement et le renouvellement de ces lymphocytes CD4 et CD8 traduisent un processus d'activation initié dans le ganglion lymphatique drainant dès que des leucocytes abritant des amastigotes cultivables/viables atteignent cet organe lymphoïde secondaire. Des mises au point sont en cours pour caractériser quels sont, parmi les différents lignages leucocytaires potentiellement "détournables" comme des leucocytes navettes (leucocytes dendritiques, polynucléaires neutrophiles, voire éosinophiles…), ceux qui le sont ou pas, ce en distinguant deux destinations : (1) le ganglion drainant, (2) les sites cutanés distants. Notons que dans les sites cutanés distants atteints par des leishmanies dont la population reste stable et faible, aucun signe clinique n'est perceptible. L'étude des processus d'établissement durable d'une population parasitaire - dont l'effectif est stable, dans un site cutané cliniquement muet – sera reprise dès que possible : pour ce faire, des leishmanies (L. major, L. amazonensis) transgéniques ont été construites (gènes codant pour des protéines naturellement fluorescentes ou pour la luciférase d'une part, gène "suicide" d'autre part). Elles sont également pour l'imagerie in vivo en temps réel, une méthode qui a aussi des applications pour cribler de nouvelles modalités de traitement des leishmanioses cutanées (collaboration avec G. Mouzot et P. Buffet).

Mots-clés: Leishmania spp., Immunophysiologie, Parasitisme intracellulaire, Programme génétique des différents stades de développement des parasites, Transmission et propriétés invasives des parasites, Pérennité


Rapports d'activité 2004 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr